姜黃素對慢性應激大鼠的神經保護作用

鄧 莉 耿春梅 廖德華 江 沛 韓文秀

1.山東省濟寧市第一人民醫院健康管理部，山東濟寧 272002；2.山東省濟寧市第一人民醫院臨床藥學科，山東濟寧 272002；3.湖南省腫瘤醫院藥學部，湖南長沙 410006

抑郁癥是一種以顯著而持久的情緒低落、興趣喪失為主要臨床特征的心理障礙疾病。近年來，抑郁癥發病率逐年攀升，嚴重影響人們的生活質量。根據2012 年世界衛生組織報告，預計到2020 年抑郁癥將成為人類第二大致殘原因，僅次于心血管疾?。?］。研究表明，慢性應激可調節下丘腦-垂體-腎上腺軸，調節神經內分泌，改變神經可塑性及神經凋亡，影響機體的整體穩態機制，進而導致抑郁的發生［2-3］。臨床廣泛應用的抗抑郁藥主要包括三環類抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑、選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑等。然而其高昂的費用、不可忽視的副作用及滯后的藥效，使新型抗抑郁藥的研發需求不斷升高。近年來，傳統中藥受到人們的重視。作為姜科姜黃屬植物根莖的天然有效成分，姜黃素具有抗炎、抗氧化、免疫調節和神經保護作用［4-6］。此外，姜黃素還能逆轉慢性應激引起的大鼠行為、記憶及認知的改變［7-8］，提示其對中樞神經系統的潛在調節作用。本實驗采用慢性不可預見性應激（CUMS）模型，探討姜黃素對慢性應激大鼠的中樞神經保護作用，為預防和早期治療慢性應激損傷及新型抗抑郁藥的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性SD 大鼠24 只，2 月齡，體重180～220 g，由湖南省腫瘤醫院動物實驗中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2018-0003，合格證號：44002700 004389。動物飼養及動物實驗方案均遵循國家《實驗動物管理條例》執行，并獲得了濟寧醫學院倫理委員會的批準。

1.2 藥物與試劑

姜黃素（美國Sigma 公司，生產批號：2142805）；大鼠皮質酮酶聯免疫試劑盒（美國Cayman 公司，生產批號：01501320）；BDNF 抗體（美國Abcam 公司，生產批號：GR42954-2）；PSD-95 抗體（美國Proteintech公司，生產批號：00025154）；SYN 抗體（美國Proteintech 公司，生產批號：00049214）；β-actin 抗體（美國Proteintech 公司，生產批號：00045582）；細胞凋亡Tunel 原位檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，生產批號：KGA702-A）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組、造模、給藥 采用隨機數字表法將24 只SD 大鼠隨機分為對照組、模型組、治療組，每組8 只。CUMS 抑郁模型構建參照文獻［9］，包括潮濕墊料（24 h）、45°傾斜籠具（24 h）、夾尾（1 min）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、束縛在空水瓶中（4 h）、晝夜顛倒（12 h/12 h）。1 周內每日給予一種不同的應激，共持續4 周。治療組造模同時每日以100 mg/kg 姜黃素溶液（懸浮于0.5%吐溫80）灌胃，對照組和模型組每日以等量生理鹽水灌胃。采用行為學實驗篩選CUMS 造模成功的大鼠，以糖水偏好性顯著下降、不動時間顯著增加為造模成功的標準。

1.3.2 糖水偏愛實驗 實驗步驟參照文獻［10］，大鼠單獨飼養，籠具兩側各放置1 瓶1%的糖水適應48 h。隨后禁水14 h，于籠具兩側放置預先稱重的清水和1%糖水各1 瓶供其自由選擇。1 h 后再次稱重，記錄1%糖水和清水消耗量。蔗糖偏好（%）=糖水消耗量/（糖水消耗量+清水消耗量）×100%。

1.3.3 強迫游泳實驗 實驗步驟參照文獻［11］，將大鼠放入高45 cm、直徑25 cm、水深35 cm、水溫24℃的塑料圓筒中。實驗開始前適應性游泳15 min，正式實驗時適應1 min，記錄5 min 內大鼠的不動時間。

1.3.4 血清皮質酮水平檢測 24 只大鼠均于早上8:00～9:00 采集靜脈血，4℃，3500 g 離心15 min 分離血清，-80℃冰箱保存備用。按照試劑盒說明書，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測定血清皮質酮水平。

1.3.5 Western blot 分析蛋白表達 大鼠行為學測試后立即處死并置于冰上，分離海馬，研磨后提取總蛋白，采用Bradford 法進行蛋白定量。取10 μg 蛋白樣品，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉膜后，封閉1 h，4℃孵育過夜。抗體濃度：BDNF（1：2000）、PSD-95（1：2000）、SYN（1：1000）、β-actin（1：4000）。TBST 洗膜后二抗孵育1 h，進行ECL 化學發光，使用Image J 軟件分析蛋白的相對表達量。

1.3.6 Tunel 染色檢測細胞凋亡情況 取大鼠腦組織在含4%多聚甲醛中固定后石蠟包埋，按照試劑盒說明書切片、脫蠟、細胞凋亡染色后置于熒光顯微鏡下觀察，棕褐色為Tunel 染色陽性的凋亡細胞。隨機選取切片5 張，每張切片隨機選取5 個視野，對陽性細胞進行計數，取平均值計算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細胞數/（正常細胞數+凋亡細胞數）×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對大鼠行為學的影響

模型組大鼠糖水偏好度顯著低于對照組，治療組大鼠糖水偏好度顯著高于模型組（P＜0.01）；模型組大鼠不動時間顯著長于對照組，治療組大鼠不動時間顯著短于模型組（P＜0.01）。見圖1。

圖1 姜黃素對大鼠行為學的影響

2.2 姜黃素對大鼠血清皮質酮水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清皮質酮水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠血清皮質酮水平顯著降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 姜黃素對大鼠血清皮質酮水平的影響

2.3 姜黃素對神經突觸可塑性的影響

與對照組比較，模型組大鼠海馬BDNF、PSD-95、SYN 蛋白表達顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠海馬BDNF、PSD-95、SYN 蛋白表達顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖3。

2.4 姜黃素對大鼠神經細胞凋亡的影響

圖3 姜黃素對神經突觸可塑性的影響

與對照組比較，模型組大鼠組織切片中凋亡陽性細胞個數明顯增加，細胞凋亡指數顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠組織切片中凋亡陽性細胞個數明顯減少，細胞凋亡指數顯著降低（P＜0.01）。見圖4。

3 討論

應激是抑郁癥重要誘發因素，長期慢性應激能夠激活HPA 軸，引起體內神經內分泌功能的紊亂［12］。此外，應激參與神經可塑性下降的調節，加速神經元細胞的凋亡，導致抑郁樣行為的產生。CUMS 抑郁模型以不同的輕度刺激因子長期刺激動物，模擬人類處于慢性低水平應激下導致的抑郁癥。該模型與抑郁癥患者的臨床表現有一定相似性，被廣泛應用于抗抑郁藥物的活性篩選和發病機制的探討。

多項研究表明，姜黃素參與調節多種神經遞質和情緒調節相關的細胞內信號通路，具有抗炎、抗氧化、調節神經突觸可塑性和細胞凋亡的作用，有很強的抗抑郁潛力［13-15］。此外，臨床試驗證實，姜黃素能夠改善抑郁癥患者的抑郁癥狀［16-19］。在此基礎上，本研究構建CUMS 經典抑郁模型，進一步驗證姜黃素的抗抑郁作用及相關機制。

本實驗結果示，姜黃素治療后大鼠的糖水偏好度升高，不動時間縮短，CUMS 誘導的大鼠抑郁樣行為得到緩解，證明了姜黃素的抗抑郁作用。長期應激導致HPA 軸過度激活，作為應激指標，皮質酮水平被廣泛應用于應激狀態的評估［20-21］。本研究結果提示，姜黃素能夠緩解CUMS 誘導的皮質酮水平升高，這可能與其調節HPA 軸神經活性有關。此外，姜黃素通過參與調節神經可塑性和細胞存活的重要細胞內信號通路，在不同動物模型中表現出保護和逆轉認知損傷的作用［22-23］。在創傷性腦損傷大鼠模型中，姜黃素能調節BDNF、cAMP 反應元件結合蛋白等相關蛋白在海馬中的表達，減輕大鼠的氧化損傷，使認知功能恢復正常［24-26］。本研究結果顯示，姜黃素能夠顯著提高海馬BDNF、PSD-95、SYN 的蛋白表達水平，改善大鼠神經突觸可塑性。同時還能降低神經細胞的凋亡率，改善細胞的存活，起到抗抑郁效果。總之，本研究提示姜黃素可能通過調節HPA 軸降低血清皮質酮水平，改善神經突觸可塑性及細胞凋亡，達到抗抑郁效果。