脂聯素對人髓核細胞增殖凋亡的調控作用

黎裕明，雷愛楓，王春梅，戴海，龐俊峰，劉會江，黃宗貴*

(1.南寧市第一人民醫院骨科，廣西 南寧 530001；2.中山大學附屬第一醫院麻醉手術科，廣東 廣州 510080；3.中山大學附屬第一醫院東院麻醉手術科，廣東 廣州 510700)

腰背痛(low back pain，LBP)一直是困擾人類生活與工作的常見疾患之一，流行病學調查證實超過80%的人在其一生中會經歷長達4周以上的腰痛[1]，目前公認腰痛的主要病因為椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)及其繼發的一系列疾病[2]。椎間盤退變的病理生理學主要表現為髓核細胞(nucleus pulposus cells，NPCs)的減少、細胞外基質的改變以及炎性細胞的浸潤[3]。髓核細胞參與合成、分泌細胞外基質，是維持椎間盤正常生理功能的關鍵細胞。[4-5]。如何維持髓核細胞數量及分泌細胞外基質功能是治療椎間盤退變的根本措施。脂聯素(adiponectin，Apn)是由脂肪細胞分泌的一種激素蛋白，研究證實Apn除具有抗炎、抗氧化等功能外，還能調控細胞增殖和細胞凋亡[6-7]。椎間盤退變進程中，髓核細胞增殖下降、凋亡增加，Apn能否調控髓核細胞增殖凋亡進程尚未清楚。本研究擬通過體外實驗，檢測Apn對人髓核細胞的調控作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 髓核組織獲取及細胞培養 人髓核細胞購自上海康朗生物科技有限公司(貨號4800 sciencell)，培養方法依照Risbud等[8]文獻報道，細胞傳代至3～5代用于后續試驗。

1.2 試劑耗材 人全長Apn(Catalog no.1065-AP；R&D公司)，MEM培養基(Gibco公司)，Adipo R1抗體(ab189446 44 kDa，Abacm公司)、Adipo R2抗體(ab126611 43 kDa，Abacm公司)，β-Tubulin Antibody抗體(#2146，CST公司)，CCK8試劑盒(Catalog no.C0038；碧云天公司)，TUNNEL試劑盒(Catalog no.12 156 792 910；Roche公司)，慢病毒LV-sh Adipo R1和LV-sh Adipo R2(購自百恩維生物)。

1.3 細胞處理 培養人髓核細胞，使用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)(50 μg/mL)刺激髓核細胞，刺激0、12、24、48及72 h后中斷反應，CCK8檢測TNF-α對髓核細胞增殖的影響，TUNEL和流式細胞儀檢測TNF-α對髓核細胞凋亡的影響。

離體培養人髓核細胞，使用不同濃度Apn聯合TNF-α處理細胞，分為四組：Ctr(對照組)、TNF-α(50μg/mL)組、TNF-α(50μg/mL)+Apn(1μg/mL)組和TNF-α(50 μg/mL)+Apn(5 μg/mL)組處理細胞，處理0、12、24、48及72 h后中斷反應，CCK8檢測TNF-α對髓核細胞增殖的影響，TUNEL和流式細胞儀檢測TNF-α對髓核細胞凋亡的影響。

為了進一步明確脂聯素受體在Apn調控髓核細胞增殖凋亡中的作用，構建慢病毒Adipo R1、Adipo R2基因沉默載體Lv-sh-Adipo R1/R2。采用實時熒光定量PCR方法檢測髓核細胞中Adipo R1、Adipo R2的基因沉默情況以確保Adipo R1、Adipo R2表達下降80%以上；檢測人髓核細胞中Adipo R1、Adipo R2基因沉默后，TNF-α對髓核細胞增殖凋亡的誘導情況：病毒轉染人髓核細胞5d后加入TNF-α誘導，處理0、12、24、48及72 h后中斷反應，CCK8檢測TNF-α對髓核細胞增殖的影響，TUNNEL和流式細胞儀檢測TNF-α對髓核細胞凋亡的影響。

1.4 Western blot檢測 微量二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白樣本、配置10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，PVDF膜將分離后蛋白轉印紙膜上，3% BSA室溫封閉1 h，cleaved-Caspase-3/8(1︰2 000)一抗4℃搖床孵育過夜，室溫二抗孵育1 h，增強化學發光法(enhanced chemiluminescence)發光液孵育并曝光。

1.5 TUNEL實驗 消化生長對數期的細胞，依據說明書將人髓核細胞以1×105/mL加入96孔板，分別給予不同分組刺激后，移除上清液并無菌磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，配置TUNEL孵育液并加入髓核細胞中孵育1 h，棄去TUNEL并PBS清洗一遍，加入DAPI(1 μg/mL)避光孵育15min，加入抗熒光淬滅液。最后熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

1.6 流式細胞實驗 依據說明書將人髓核細胞以1×106/孔接種于6孔板，分別給予不同分組刺激后，移除上清液并PBS清洗，胰酶消化細胞、血清終止，離心后重新懸浮清洗細胞，調整細胞密度為5×105～1×106/mL。取100 μL細胞懸液于5 mL流式細胞管中，加入Annexin V-FITC 5μL和10 mg/L碘化丙啶10 μL，混勻后室溫避光孵育15 min，加入400 μL稀釋好的結合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 Lv-sh-Adipo R1/R2感染髓核細胞及驗證 人髓核細胞感染Lv-sh-Adipo R1/R2慢病毒后，轉染72 h后熒光顯微鏡顯示髓核細胞激發出大量綠色熒光；RT-PCR及Western Blot檢驗結果顯示髓核細胞內Adipo R1/R2 mRNA表達顯著下降，提示基因沉默成功，見圖1～6。

圖1 Lv-sh-Adipo R1組髓核細胞激光共聚焦顯微鏡檢測結果

注：*組間比較差異有統計學意義，P<0.05

注：*組間比較差異有統計學意義，P<0.05

圖4 Lv-sh-AdipoR2組髓核細胞激光共聚焦顯微鏡檢測結果

注：*組間比較差異有統計學意義，P<0.05

注：*組間比較差異有統計學意義，P<0.05

2.2 Apn對人髓核細胞增殖的影響 離體培養人髓核細胞，使用不同濃度Apn聯合TNF-α處理細胞，處理0、24、48及72 h后中斷反應，CCK8檢測TNF-α對髓核細胞增殖的影響。結果發現TNF-α抑制人髓核細胞增殖，Apn能夠拮抗TNF-α對人髓核細胞增殖的抑制作用，并且呈劑量效應(見圖7)。

圖7 Apn對人髓核細胞增殖的影響

2.3 Apn對人髓核細胞凋亡的影響 采用上述組別處理人髓核細胞，處理12h后收集細胞采用TUNEL檢測細胞凋亡，另采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果顯示TNF-α促進髓核細胞凋亡，Apn能夠拮抗TNF-α對人髓核細胞的促凋亡作用(見圖8)。

2.4 Adipo R1/R2對髓核細胞增殖凋亡的影響 應用慢病毒技術沉默髓核細胞內Adipo R1/R2后，再給予TNF-α刺激髓核細胞，CCK8檢測Adipo R1/R2對髓核細胞增殖的影響，發現TNF-α抑制人髓核細胞增殖，沉默Adipo R1/R2能夠增強TNF-α對人髓核細胞增殖的抑制作用(見圖9)。

a TUNNEL檢測結果

注：*組間比較差異有統計學意義，P<0.05

c 流式細胞儀檢測結果

注：*組間比較差異有統計學意義，P<0.05

圖9 Adipo R1/R2對髓核細胞增殖凋亡的影響

流式細胞儀檢測Adipo R1/R2對髓核細胞凋亡的影響，結果顯示TNF-α促進髓核細胞凋亡，沉默Adipo R1/R2能夠增強TNF-α對人髓核細胞凋亡的促進作用(見圖10)。

a 流式細胞儀檢測結果

注：*組間比較差異有統計學意義，P<0.05

3 討 論

椎間盤退變是一個與年齡密切相關的病理生理學過程，其典型特征為髓核組織正常結構喪失和進行性纖維化；髓核組織是椎間盤行使生物力學功能的中心，其形態及理化性質的改變是椎間盤退變的主要病理學改變[7]。導致以上病理改變的主要原因包括兩大方面：髓核細胞數量減少和功能下降[8]。髓核細胞合成、分泌的細胞外基質是椎間盤髓核組織的主要組成部分。髓核細胞的數量減少(如NPCs凋亡及細胞增殖功能減低)與功能下降(如蛋白多糖、Ⅱ型膠原的合成減少)直接導致了髓核組織的各種病理學改變[9]。此外，退變椎間盤的髓核還產生多種炎性因子和參與細胞外基質降解的蛋白酶與水解酶，如白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、TNF-α、去整合素和金屬蛋白酶、基質金屬蛋白酶、氧自由基等，加速細胞外基質的分解代謝，最終導致椎間盤的退變[10-11]。

脂聯素(adiponectin，Apn)是由脂肪細胞分泌的一種激素蛋白，多項研究證實Apn具有抗炎、抗氧化應激等功用[12]。研究發現Apn能夠通過兩個受體Adipo R1、Adipo R2抑制髓核細胞合成分泌疼痛介質前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE-2)，提示Apn可能為一個保護性因子，在椎間盤源性腰痛環境中發揮抗炎作用[13]。Terashima等[14]研究發現Adipo R1、Adipo R2在椎間盤退變進程中呈下降趨勢，Apn能抑制IL-1β對髓核細胞合成分泌TNF-α的促進作用，提示Apn參與了椎間盤退變的進程。Yuan等[15]報道退變椎間盤內Apn表達下降，外源性Apn能抑制退變椎間盤髓核細胞合成分泌TNF-α、并且呈劑量時間依賴性，提示Apn通過下調髓核細胞合成分泌TNF-α從而發揮其抗炎作用。然而目前尚不清楚Apn能否調控髓核細胞增殖凋亡進程。

研究證實Apn除具有抗炎、抗氧化等功能外，還能調控細胞增殖和細胞凋亡，并且其功能具有細胞組織特異性[4-5]。Dieudonne等[16]研究發現Apn能通過促進細胞凋亡和抑制細胞周期從而抑制人乳腺癌細胞的增殖。Rakatzi等[17]發現Apn在胰島B細胞中具有抗凋亡作用，能對抗炎癥因子和脂肪酸對胰島B細胞的凋亡誘導。DiMascio等[18]研究發現Apn和其受體Adipo R1/2在造血干細胞中均有表達，Apn能促進造血干細胞的增殖并抑制其凋亡。Zhang等[19]發現Adipo R1/2表達與海馬神經干細胞，Apn能促進海馬神經干細胞增殖、并呈時間劑量依賴性，卻不影響神經干細胞的凋亡和分化功能。付宗杰等[20]研究發現Apn可以促進骨髓間充質干細胞增殖，并減少缺氧、缺糖損傷后骨髓間充質干細胞凋亡。以上研究證實Apn廣泛參與了各個細胞系的增殖凋亡進程，并且具有細胞差異性。本研究發現TNF-α能抑制髓核細胞增殖并誘導髓核凋亡，脂聯素能逆轉TNF-α對髓核細胞增殖和凋亡的調控作用(P<0.05)。Adipo R1/2沉默后，髓核細胞增殖受到抑制、凋亡升高，其中以Adipo R2為著(P<0.05)。此外，Adipo R1/2沉默能增強TNF-α對髓核細胞cleaved-Caspase-3/8的誘導作用。

綜上所述，本研究通過慢病毒基因沉默等試驗手段發現Apn能夠通過兩個受體Adipo R1、Adipo R2參與髓核細胞增殖凋亡進程，Apn促進髓核細胞增殖和抑制髓核細胞凋亡，提示Apn可能作為一個保護性因子在椎間盤退變進程中發揮抗凋亡作用。因此，接下來可以通過體內外實驗深入了解Apn在椎間盤退變中的作用及相關機制。