逍遙解郁方對卒中后抑郁大鼠5-HT含量及其受體表達(dá)影響的研究*

吳春嵐，王長德，陳 婡

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(上海200082)

卒中后抑郁(Post-stork depression，PSD)是卒中常見的并發(fā)癥之一，以情緒低落、興趣減退、思維遲緩及睡眠障礙為主要表現(xiàn)的疾病，嚴(yán)重影響卒中患者的治療、康復(fù)及預(yù)后，增加卒中患者的致殘率及死亡率。大型流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，39.3% ～ 70% 的腦卒中患者存在 PSD，而患有 PSD 患者病死率較單純腦卒中患者高出 3 ～ 4 倍，因此臨床將 PSD 視為預(yù)防二次腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。西醫(yī)抗抑郁藥是目前治療該疾病的主要手段，但因其副作用明顯，患者耐受性差、醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重等影響治療的依從性。卒中后抑郁屬中醫(yī)學(xué)“郁證”與“中風(fēng)”之合病，在中風(fēng)的基礎(chǔ)上， 因風(fēng)、火、痰、瘀郁結(jié)導(dǎo)致機(jī)體氣血郁滯、肝失疏泄而出現(xiàn)情緒低落等抑郁的表現(xiàn)。肝喜條達(dá)，調(diào)暢全身氣機(jī)， 各種病因致肝臟功能失調(diào)，影響肝臟對氣機(jī)的調(diào)節(jié)作用，故生風(fēng)，誠如《內(nèi)經(jīng)》所言：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”。因此，疏肝行氣解郁為卒中后抑郁的治療原則。逍遙解郁方在我科臨床使用多年，具有一定的臨床療效，且副作用小，具有一定的研究潛力和優(yōu)勢[2]。本研究通過比較藥物干預(yù)后大鼠5-HT含量及-HT1AR與5-HT2AR mRNA表達(dá)變化探討逍遙解郁方治療卒中后抑郁方的可能作用機(jī)制及療效。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：選取SPF級，SD大鼠50只，體重200～240 g，購自于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，動物許可證號：SCXK(滬)2015-0016。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物:逍遙解郁方由柴胡、當(dāng)歸、枳殼、合歡皮、炒棗仁、白術(shù)各15 g，香附、郁金、石菖蒲各12 g，白芍、夜交藤各30 g組成，以上中藥由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制備成顆粒劑形式。鹽酸氟西汀膠囊(美國禮來蘇州制藥有限公司生產(chǎn)，批號5558A)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑:實(shí)驗(yàn)涉及儀器包括：ABI-7300型Real-time檢測儀(ABI公司)；紫外分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器廠)；TG-16M型低溫冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；K30型旋渦振蕩器(青浦瀘西儀器廠)；PRO200型電動勻漿機(jī)(FLUKO)等。大鼠5-羥色胺酶聯(lián)免疫分析試劑盒(貨號RA20031)；大鼠Trizol試劑盒(貨號1596-026)等。

2 方 法

2.1 分組與給藥方法:50只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白組、模型組、氟西汀組、中藥低劑量組和中藥高劑量組，每組10只。卒中后抑郁模型建立成功后，分別對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評估(包括：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[3]和糖水偏好試驗(yàn)等[4])，各組大鼠按照：空白組和模型組[蒸餾水10 ml/(kg·d)、氟西汀組1.84 mg/(kg·d)]和中藥低、高劑量組[分別按生藥5.99 g/(kg·d),11.99 g/(kg·d)]方式連續(xù)灌胃28 d，給藥結(jié)束后再次進(jìn)行行為學(xué)評定。

2.2 卒中后抑郁模型的建立:腦卒中模型的復(fù)制參照Koizumi等[5]方法進(jìn)行改良，采用頸內(nèi)動脈線栓法制備MCAO模型，術(shù)后24h按Zea Longa標(biāo)準(zhǔn)[2]行神經(jīng)功能評分。在腦卒中模型基礎(chǔ)上采用慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激(CUMS)法聯(lián)合孤養(yǎng)法制備卒中后抑郁模型[3]。

2.3 大鼠血清5-HT含量測定:取大鼠血漿根據(jù)要求選擇EDTA作為抗凝劑，2～8℃1000×g離心15 min左右，取上清液，-80℃保存，按照試劑盒說明書操作測定各組大鼠血清5-HT含量。

2.4 大鼠海馬5-HT1AR與5-HT2AR mRNA表達(dá)水平檢測:取大鼠海馬組織于1 ml的Trizol的勻漿管中，于勻漿機(jī)勻漿20 s，立即放于冰上；置于超凈臺中，溫育5 min，12000 r/min，離心10 min；吸上清于新的1.5 ml離心管中，加入200 μl的氯仿，搖勻，室溫靜置2 min，4 ℃，12000 r/min，離心10 min；吸取上清于新的1.5 ml離心管中，加入600 μl的異丙醇，混合均勻，室溫靜置15 min，4℃，12000 r/min，離心15 min，棄上清；加入1 ml的75%的無水乙醇(750 μl無水乙醇+250μl DEPC水)漂洗沉淀，4℃，12000 r/min，離心5 min，棄上清；加入1 ml無水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000 r/min，離心5 min，棄上清，室溫干燥10 min；加入40 μl的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫唧w操作及數(shù)據(jù)處理見試劑盒說明書。PCR引物序列及擴(kuò)增長度見表1。

表1 PCR引物序列、擴(kuò)增長度

結(jié) 果

1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 由表2發(fā)現(xiàn)，給藥前，各組PSD大鼠與空白組比較，其不動時間明顯增加，掙扎時間明顯減少(P<0.01)，提示造模成功。治療后，與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠掙扎時間明顯延長(P<0.01)，且各中藥干預(yù)組大鼠不動時間均明顯減少(P<0.01)；與氟西汀組比較，中藥低劑量組大鼠不動時間無明顯差異(P>0.05)，但掙扎時間明顯延長(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組大鼠不動時間減少及掙扎時間增多更顯著(P<0.01)。

表2 各組大鼠強(qiáng)迫游泳時間比較(s)

2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 由表3發(fā)現(xiàn)，給藥前，各組PSD大鼠糖水消耗量與空白組比較均顯著減少(P<0.05)，提示造模成功。治療后，與模型組比較，各藥物干預(yù)組糖水消耗量均增加(P<0.05)，提示以上3組藥物治療均有效。進(jìn)一步觀察，與氟西汀組比較，中藥低劑量組大鼠糖水消耗明顯減少(P<0.05)，中藥高劑量組大鼠糖水消耗無明顯差異(P>0.05)，提示逍遙解郁方高劑量組與氟西汀組療效相當(dāng)。糖水偏好度(%)=飲用糖水量/總飲水量×100%

3 卒中后抑郁大鼠海馬5-HT及其受體表達(dá) 由表4發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，各組大鼠血清5-HT含量明顯降低(P<0.01)，提示造模成功。除空白組外，其余各組均表現(xiàn)為低血清5-HT濃度伴隨海馬組織5-HT1AR低表達(dá)及5-HT2AR高表達(dá)。與模型組比較，各組大鼠血清5-HT濃度明顯增加，同時伴海馬5-HT1AR表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)，中藥低劑量組5-HT2AR表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，但中藥高劑量組和氟西汀組5-HT2AR表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組和氟西汀組5-HT2AR表達(dá)亦明顯減少(P<0.01)。

表3 各組大鼠糖水偏好度比較(%)

表4 各組大鼠海馬5-HT含量及其受體5-HT1AR、5-HT2AR表達(dá)比較

討 論

郁證的發(fā)病多由七情所傷，肝氣郁結(jié)；思慮勞倦，脾失健運(yùn)；臟氣素虛，復(fù)加情志勞傷而成。卒中后抑郁屬于中醫(yī)“郁證”范疇，結(jié)合其中風(fēng)后發(fā)病的特點(diǎn)，考慮其主要病機(jī)主要為脾虛濕困，氣滯血瘀，痰瘀交阻，肝氣郁結(jié)。我們經(jīng)長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)逍遙解郁方對卒中后抑郁患者治療有效。中風(fēng)發(fā)病多由虛(陰虛、氣虛)、火(肝火、心火)、風(fēng)(肝風(fēng)、外風(fēng))、痰(風(fēng)痰、濕痰)、氣(氣逆)、血(血瘀)六端相干為病，卒中后抑郁在此基礎(chǔ)上復(fù)因情志不暢而治病，臨床可表現(xiàn)為情志抑郁易怒，胸悶，善太息，腹脹噯氣，食欲不振，夜寐多夢，驚惕不安等。逍遙解郁方由《太平惠民和劑局方》中的逍遙散合《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》中的柴胡疏肝散化裁而來。方中柴胡、香附均性苦平，疏肝解郁，行氣活血，共為君藥；白芍酸苦微寒，養(yǎng)血斂陰，柔肝緩急；當(dāng)歸甘辛苦溫，養(yǎng)血和血，且其味辛散，乃血中氣藥。當(dāng)歸與白芍同用，補(bǔ)肝體調(diào)肝用，使血和則肝和，血充則肝柔，共為臣藥；木郁則土衰，肝病易傳脾，故以白術(shù)補(bǔ)氣健脾、燥濕利水，枳殼理氣寬胸、消脹除痞，非但實(shí)土以御木乘，且使生化有源，又能調(diào)暢氣機(jī)，補(bǔ)而不滯，共為佐藥；合而成方，深合《素問·臟氣法時論》“肝苦急，急食甘以緩之”，“脾欲緩，急食甘以緩之”，“肝欲散，急食辛以散之”之旨。可使肝郁得疏，血虛得養(yǎng)，脾弱得復(fù)，濕重得化，氣血兼顧，肝脾同調(diào)。同時，結(jié)合臨床患者頭暈頭重，夜寐不安等臨床表現(xiàn)，以菖蒲配伍郁金健脾化濕、開竅清心，棗仁、合歡皮、夜交藤同用養(yǎng)心安神。

卒中后抑郁屬于繼發(fā)性抑郁，抑郁癥的發(fā)生與遺傳、生物化學(xué)、心理、社會和環(huán)境等多種因素有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。目前有關(guān)PSD的神經(jīng)生化研究主要集中在單胺能神經(jīng)遞質(zhì)假說，即5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)低下假說，尤其是5-羥色胺信號減弱被公認(rèn)是抑郁癥的生物學(xué)基礎(chǔ)。早在20世紀(jì)80年代，Robinson等[6]就提出，5-HT作為腦內(nèi)參與情感調(diào)節(jié)的神經(jīng)元，其軸突通過丘腦和基底節(jié)到達(dá)額葉皮層，腦卒中病變累及上述部位可影響5-HT神經(jīng)通路，導(dǎo)致5-HT遞質(zhì)水平降低而引起抑郁。臨床上使用5-HT再攝取抑制劑(SSRI)可緩解PSD癥狀，進(jìn)一步支持PSD與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)下降有關(guān)的觀點(diǎn)[7-11]。目前普遍認(rèn)為，5-HT1AR和5-HT2AR均屬于自身受體，多分布在情感調(diào)節(jié)有關(guān)的邊緣系統(tǒng)中，尤其是海馬、額葉和中縫核，與抑郁癥關(guān)系密切[12-14]。當(dāng)突觸后膜5-HT1AR水平降低和5-HT2AR水平升高均會抑制5-HT的釋放，前者對5-HT的釋放起負(fù)反饋?zhàn)饔茫笳邉t對5-HT的釋放起正反饋?zhàn)饔茫罱K導(dǎo)致細(xì)胞間隙內(nèi)5-HT濃度降低，從而導(dǎo)致抑郁[15-17]。本次研究以5-HT1AR和5-HT2AR為切入點(diǎn)，探討逍遙解郁方治療卒中后抑郁可能的作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：逍遙解郁方高、低劑量和鹽酸氟西汀均可以上調(diào)5-HT1ARmRNA表達(dá)和下調(diào)5-HT2ARmRNA表達(dá)，PSD大鼠海馬5-HT含量增加，抑郁癥狀得到改善。該研究結(jié)論與大量動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[18-20]。其次，由中藥高、低劑量療效比較，我們發(fā)現(xiàn)逍遙解郁方對抑郁改善程度上可能存在濃度依賴性。但是由于本次實(shí)驗(yàn)動物樣本量太少，研究結(jié)論僅視為探索性研究，后期有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量就該結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)的藥物量效關(guān)系有待進(jìn)一步摸索論證。此外，動物模型療效是否與人體臨床療效相匹配需要臨床觀察性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，同時藥物應(yīng)用于臨床還需對其安全性進(jìn)行監(jiān)測評估。