聯合檢測CK19、BRAF及FAK在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價值

史國恩，包萬智，李軼春，陳曉明，蔡漢章，潘能武

廣西北海市中醫醫院普外科,廣西北海 536000

甲狀腺乳頭狀癌起源于濾泡上皮細胞，是一種分化良好的惡性腫瘤，占原發性甲狀腺惡性腫瘤的55%～65%，可發生在任何年齡，多見于40歲以下，男女比例為1∶(2～4)。5年生存率為73%～93%，10年生存率為60%～83%[1]。據統計近年來甲狀腺癌發病率呈上升趨勢。隨著免疫組化的發展，早期診斷和及時治療是提高甲狀腺乳頭狀癌生存率的關鍵。細胞角蛋白19(CK19)的聯合檢測BRAF基因表達、粘著斑激酶(FAK)、CK19、BRAF 和 FAK 均在甲狀腺乳頭狀癌[2]中高表達，提示CK19、FAK和BRAF的表達可能與腫瘤的發生有關。該文收集了該院2013年1月—2018年1月收治的60例甲狀腺乳頭狀癌的存檔蠟塊，以分析細胞角蛋白19(CK19)、BRAF基因表達、粘著斑激酶(FAK)在甲狀腺癌中的表達，探討CK19、BRAF和FAK在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在該院治療的甲狀腺乳頭狀癌60例。其中男13例，女47例，年齡最小23歲。最大年齡為73歲，平均年齡為(48.5±6.7)歲；所有標本均經術后病理診斷為乳頭狀甲狀腺癌，甲狀腺乳頭狀癌患者術前未接受放療或化療。研究所選病例已經過倫理委員會批準，患者或其家屬對該研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 應用試劑 鼠抗人CK19單克隆抗體，濃縮型鼠抗人FAK單克隆抗體和Envision檢測試劑盒，聚合酶鏈式反應試劑和基因組DNA抽提試劑盒[3]。

1.2.2 操作方法 ①免疫組化法檢測 CK19、FAK、BRAF蛋白表達，使用Envision兩步法，將陽性切片作為對照品，將PBS作為陰性對照。每個切片選擇5次四百次視野，計數陽性細胞百分率和著色度計分，根據視野內陽性細胞所占比記錄陽性細胞百分比，包括無著色為 0分，＜25%記作1分，26%～50%記作2分，51%～75%記作3分，＞75%記作4分[4]。根據陽性細胞著色特征將其記錄為無著色記作0分，淡黃色記作1分，棕黃色記作2分，棕褐色記作3分，將上述結果相加，0分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為中等陽性，6～7分為強陽性。②聚合酶鏈反應和DNA測序檢測BRAF突變，根據DNA提取試劑盒的說明書從組織標本中提取DNA，然后用上游引物和下游引物擴增DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳證實產物可靠性，之后將產物進行DNA測序，將結果與DNA序列進行比較，明確其突變情況[5]。觀察CK19、BRAF和FAK蛋白在乳頭狀癌組織中的表達，比較CK19、BRAF和FAK蛋白標志物的敏感性和特異性，以及與臨床病理參數腫塊大小、淋巴結侵襲、局部復發的相關性。

1.3 統計方法

采用SPSS 20.0統計軟件對所有患者的資料進行分析處理，計數資料采用%表示，進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CK19、FAK、BRAF 蛋白表達

CK19表達部位在細胞膜和細胞質當中，患者陽性表達率為100.00%；FAK在細胞核或細胞質中呈棕黃色顆粒陽性，少數核染色，患者陽性表達率為73.50%，主要表現為中等及以上強度；BRAF蛋白表達部位在細胞膜，部分觀察到腺腔邊緣著色，患者陽性表達率為63.33%，主要表現為中等及以上強度。CK19、FAK、BRAF蛋白表達在患者當中的表達情況見表1。

表1 該組患者CK19、FAK、BRAF蛋白表達

2.2 患者 CK19、CK19、FAK、BRAF蛋白表達與病理參數的關系

不同年齡、性別、腫瘤大小及淋巴結轉移情況CK19、FAK、BRAF蛋白表達均差異無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

表2 患者CK19、FAK、BRAF蛋白表達與病理參數的關系

CK19(+)特異性和敏感性在甲狀腺乳頭狀癌中分別為49.90%和100.00%；FAK(+)特異度和靈敏度分別為73.50%和96.50%；BRAF(+)的特異性和敏感性分別為 63.30%和 97.70%；BRAF(+)聯合 FAK(+)的特異性和敏感性分別為97.30%和95.30%；BRAF(+)與CK19(+)聯合的特異性和敏感性分別為95.80%和94.60%。CK19(+)與FAK(+)靈敏度分別為92.90%和94.70%；CK19(+)聯合 BRAF(+)、FAK(+)特異度和靈敏度分別為94.20%和98.80%；CK19聯合其他指標表達比較可以看出，BRAF、CK19或者FAK同時表達對甲狀腺乳頭狀癌診斷鑒別的特異度和靈敏度最高。

2.3 患者BRAF基因突變情況分析

按照BRAF基因突變測序結果可以看出，該組38例外顯子15突變1 799例，屬于雜合突變，突變率為63.33%。BRAF基因突變在不同年齡段、性別、腫瘤大小和淋巴結轉移當中差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

甲狀腺癌是內分泌系統常見的惡性腫瘤，甲狀腺乳頭狀癌約占80%；全球甲狀腺癌發病率為1%～2%[6]，中國甲狀腺癌的年發病率為0.5～40人/100 000。雖然絕大多數甲狀腺癌可以通過手術和藥物治療治愈，但10%～20%的患者仍然死于腫瘤的低分化和進展。近年來中國甲狀腺癌發病率逐年上升，尤其是女性，對人類健康有害。甲狀腺癌的具體病因尚不清楚，但多年的臨床和流行病學研究發現，放療、激素效應、碘攝入量等與甲狀腺癌的發生有關。

CK19為I型CK，分子量為40 KD；其主要表達于單層上皮細胞，分布于扁平鱗狀上皮基底細胞。國內外許多研究者[7-10]已發現CK19在乳腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、大腸癌、膀胱癌、肺鱗癌等多種腫瘤組織中的表達。近年來國內學者對低分子量角蛋白CK19在甲狀腺病變中的表達進行了研究，發現其在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈強而彌漫的表達，而在正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤、結節性甲狀腺腫或局灶性表達中則不表達，推測CK19可能參與甲狀腺乳頭癌的發生和發展與腫瘤的轉移有關。

BRAF位于7q34，能有效地作用于MAPK信號通路，BRAF基因突變發生在甲狀腺癌患者中，常見突變點為第15外顯子1799位點；此次研究結果顯示38例BRAF突變，突變率為63.33%，并且與不同年齡、性別、腫瘤大小和淋巴結轉移無顯著差異。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，它與酪氨酸激酶2和細胞黏附激酶β形成FAK家族，FAK抑制細胞凋亡，FAK是一個依賴于錨的生存信號，當FAK表達在腫瘤細胞中被抑制時，可引起細胞凋亡。FAK的高表達可增強細胞外信號的存活，抑制腫瘤細胞失去粘附后的失巢凋亡，促進腫瘤細胞的增殖和遷移。此次研究結果表明，FAK在甲狀腺乳頭狀癌中呈陽性表達，FAK的高表達增加了甲狀腺乳頭狀癌的細胞外存活信號，FAK在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移中起重要作用。

該次研究結果顯示甲狀腺乳頭狀癌患者的CK19陽性表達率為100.00%，FAK陽性表達率為73.5%，BRAF突變率為 63.33%，張芳等[11]在 CD56、CK19及BRAF診斷甲狀腺乳頭狀癌的研究中得出30例甲狀腺乳頭狀癌患者中CK19陽性表達例數為29例，陽性表達率為96.70%，BRAF突變率為63.33%，與該次研究結果相近，而高玉寶等[12]在研究中得出FAK在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達率為75.00%，與該次研究結果相近。可見CK19、FAK陽性表達和BRAF突變與甲狀腺乳頭狀癌的發生存在密切關系。

4 結語

CK19、FAK和BRAF聯合檢測對甲狀腺乳頭狀癌的敏感性、特異性分別為94.60%和98.80%，高于單抗體或其他兩種組合。綜上所述在診斷甲狀腺乳頭狀癌患者時，聯合檢測CK19、FAK、BRAF表達的病理價值比較高，并且BRAF突變時導致患者出現甲狀腺乳頭狀癌的重要指標，對甲狀腺乳頭狀癌的臨床確診具有顯著作用。