脂氧素A4對異氟烷所致老齡大鼠認知功能障礙的影響*

張建芳，李世勇，韓嬙，羅愛林，任杰

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院麻醉學教研室，武漢 430030；2.濟南市中心醫(yī)院麻醉科，濟南 250000)

老年(≥60歲)患者接受全身麻醉手術后，約41.4%可發(fā)生術后認知功能障礙(postoperation cognitive dysfunction，POCD)，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量并增加了社會醫(yī)療保健負擔，目前臨床尚無有效的防治方法[1]。雖然POCD的發(fā)病機制尚不清楚，但多項研究顯示，全身麻醉藥是引起POCD的主要原因之一[2]。臨床相關濃度異氟烷可致實驗動物腦內(nèi)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)過度表達，進而導致神經(jīng)元損傷，最終引起認知功能障礙[3-4]。脂氧素A4 (lipoxin A4，LXA4)是一類重要的內(nèi)源性促炎癥消退脂類遞質(zhì)，被稱為炎癥反應的“剎車信號”[5-6]。研究表明，LXA4可通過血腦屏障，抑制腦缺血及其他神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)炎癥反應，從而減輕神經(jīng)細胞損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7]。但LXA4能否減輕異氟烷誘發(fā)的老年大鼠海馬神經(jīng)炎癥及認知功能損傷尚不清楚。筆者在本研究觀察LXA4預處理對異氟烷所致老年大鼠海馬炎癥反應和認知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，18～20個月齡，體質(zhì)量350～400 g，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2004-0007，實驗動物合格證號：NO.4200400243。飼養(yǎng)于溫度(22±1)℃、相對濕度(60±5)%、明暗各12 h交替(7：00—19：00)通風干燥環(huán)境，提供充足的標準化飲食。

1.2藥品與試劑 LXA4 購自美國Sigma公司(批號：437720)，異氟烷購自美國Baxter公司(批號：N008B008)，核因子κB抑制因子α(nuclear factor of kappa alpha，IκBα)購自美國Sigma公司(批號：BAY 11-7082)，酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA )試劑盒購自美國BioSource公司(IL-6批號：145466017，IL-1β批號：145530029，TNF-α批號：145356008)。

1.3儀器與設備 Biomedical全自動血氣分析儀(美國NOVA公司，型號：PHOX PLUS)，Ethovision動物運動軌跡記錄系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司，型號：ETHOVISION PRO)。

1.4實驗分組與給藥方法 采用隨機數(shù)字表法，將SD大鼠隨機分為4組(n=30)：對照組(C組)、異氟烷組(I組)、LXA4+異氟烷組(L+I組)和LXA4組(L組)。異氟烷麻醉開始前，L組和L+I組腦室注射0.3 nmol·L-1LXA4 5 μL(溶于0.9%氯化鈉溶液)[7]。C組和I組給予等量0.9%氯化鈉溶液。將大鼠放入麻醉箱中，麻醉箱放入25 ℃恒溫箱內(nèi)與麻醉機相連，以30%O2-70%N2混合氣體作為載體氣體，通氣流量2 L·min-1。C組和L組大鼠給予30%O2-70%N2混合氣體6 h，I組和L+I組大鼠給予1.4%異氟烷6 h。麻醉完成后關閉異氟烷揮發(fā)罐，繼續(xù)保持通氣。

1.5動脈血氣分析 麻醉結束后，用32號針頭立即取左心室血液200 μL，采用Biomedical全自動血氣分析儀進行動脈血氣分析，測定血氣指標和血糖水平。

1.6炎癥因子檢測 麻醉結束后，每組每個時間點(麻醉后0，3，6，12和24 h)取大鼠5只，按照ELISA 試劑盒說明書檢測海馬TNF-α、IL-1β 和IL-6表達。

1.7Western blotting檢測海馬組織蛋白 冰上分離大鼠海馬組織后裂解，提取總蛋白。Western blotting法檢測海馬組織相應蛋白水平。Image Lab 3.0版軟件進行灰度分析。以目的蛋白與β-actin灰度值的比值反映其表達水平。

1.8認知功能測定 待其余大鼠完全清醒后送回籠中，麻醉結束后第2周參照文獻[8]進行Morris水迷宮實驗。Ethovision動物運動軌跡記錄系統(tǒng)自動記錄大鼠游泳軌跡。以大鼠入水至爬上平臺的時間為逃避潛伏期，取每天測試平均值。將60 s內(nèi)找不到平臺的大鼠放于平臺上15 s，逃避潛伏期記為60 s，連續(xù)訓練4 d，記錄逃避潛伏期。于第5天將平臺撤去。從同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠在4個象限的游泳時間百分比及穿過原平臺所在位置的次數(shù)。

2 結果

2.1異氟烷麻醉對大鼠循環(huán)和呼吸功能的影響 見表1。4組大鼠血液pH值、二氧化碳分壓(PaCO2)、氧分壓(PaO2)、血糖及氧飽和度(SaO2)比較，均差異無統(tǒng)計學意義。提示異氟烷麻醉對大鼠循環(huán)和呼吸功能無影響。

2.2LXA4預處理改善異氟烷麻醉后認知功能 訓練的第3天和第4天，與I組比較，L+I組大鼠定位平臺時間更短，在目標象限時間百分比更大(P<0.05)。L組與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.3LXA4對異氟烷誘導的海馬內(nèi)炎癥因子水平上調(diào)及IκBα表達水平下調(diào)的影響 與C組比較，I組麻醉后0，3，6 h海馬內(nèi)IL-1β和 IL-6表達明顯上調(diào)(P<0.05)，麻醉12 h后達基線水平；麻醉后0，3，6，12 h海馬內(nèi)TNF-α表達明顯上調(diào)(P<0.05)，麻醉24 h后達基線水平；麻醉后0，3，6 h海馬內(nèi)IκBα表達下調(diào)(P<0.05)，12 h后恢復正常；與I組比較，L+I組麻醉后0，3，6 h海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β和 IL-6表達下調(diào)，IκBα表達上調(diào)(P<0.05)；各時間點L組和L+I組海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6 及IκBα表達差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

表14組大鼠動脈血氣指標和血糖水平比較

Tab.1Comparisonofarterialbloodgasindexandbloodglucoselevelsamongfourgroupsofrats

組別pH值PaCO2PaO2kPaC組7.31±0.054.80±0.5913.97±1.73I組7.33±0.044.83±0.3314.23±1.46L+I組7.32±0.065.16±0.4913.83±1.20L組7.31±0.045.28±0.3114.36±1.60組別血糖/(mmol·L-1)SaO2/%C組4.42±0.3398.87±0.95I組4.58±0.4697.25±0.76L+I組4.25±0.6696.78±0.89L組4.44±0.6199.24±0.73

2.4異氟烷和 LXA4對海馬內(nèi)IκBα表達水平的影響 麻醉后2周，與C組比較，I組IκBα表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與I組比較，I+L組IκBα表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。提示異氟烷和 LXA4對海馬內(nèi)IκBα表達水平的影響持續(xù)時間不長。

3 討論

異氟烷是臨床常用吸入麻醉藥，研究證實，1.4%異氟烷處理小鼠2，6，24 h后，海馬內(nèi)TNF-α、IL-1和IL-6表達增高，誘導神經(jīng)炎癥發(fā)生和發(fā)展，損傷學習和記憶功能[3，9]。1.4%異氟烷與臨床麻醉所用的濃度接近，筆者在本研究選擇1.4%異氟烷麻醉6 h建立異氟烷誘發(fā)老年大鼠認知功能障礙模型。異氟烷處理過程中，各組動脈血氣和血糖指標差異無統(tǒng)計學意義，表明異氟烷未對循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生明顯抑制。

研究表明，在神經(jīng)退行性疾病中，TNF-α和 IL-1β參與了海馬內(nèi)神經(jīng)炎癥反應，而阻止TNF-α和 IL-1β釋放可以改善認知功能[10]。筆者在本研究發(fā)現(xiàn)，與C組比較，I組麻醉后0，3，6 h TNF-α、IL-1β和 IL-6表達明顯上調(diào)；麻醉后0，3，6 hIκBα表達下調(diào)，第3～4天逃避潛伏期延長，探索時間縮短。提示1.4%異氟烷可誘導海馬內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6釋放，可能參與誘導神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展，從而導致老年大鼠發(fā)生認知功能障礙。

與C組比較，*1P<0.05；與I組比較，*2P<0.05

Compared with group C,*1P<0.05; Compared with group I,*2P<0.05

LXA4是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，在炎癥等病理過程中具有抗炎和促炎癥消退作用[11]。在諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，LXA4可以通過抑制膠質(zhì)細胞激活、降低炎癥因子(TNF-α、IL-1β)活性等發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，與I組比較，L+I組在麻醉結束后0，3，6 h TNF-α、IL-1β和 IL-6表達下調(diào)，IκBα表達上調(diào)，LXA4預處理可抑制異氟烷誘導的炎癥因子的增加；L組和L+I組各時間點TNF-α、IL-1β及IL-6表達差異無統(tǒng)計學意義；麻醉結束后24 h，各組TNF-α、IL-1β及IL-6差異無統(tǒng)計學意義。與I組比較，L+I組第3～4天逃避潛伏期縮短，探索時間延長，提示LXA4預處理可減輕異氟烷誘發(fā)的神經(jīng)炎癥反應，改善異氟烷麻醉誘發(fā)的老齡大鼠認知功能障礙。

LXA4能抑制炎性刺激引起的多種細胞因子、趨化因子、黏附分子表達，其機制與抑制NF-κB活性相關[11]，而IκBα降解是NF-κB釋放的中心環(huán)節(jié)[13]。LXA4抑制TNF-α、IL-1β和 IL-6增加，其機制可能是抑制IκBα蛋白降解，通過衰減IκBα降解抑制NF-κB轉錄活性，從而抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和 IL-6等的釋放，減輕神經(jīng)炎癥反應，改善認知功能。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，與C 組比較，I組麻醉后0，3，6 h IκBα表達下調(diào)，12 h后恢復正常；與I組比較，L+I組IκBα表達上調(diào)；L組和L+I組各時間點IκBα表達差異無統(tǒng)計學意義。

A-C.大鼠海馬TNF-α、IL-1β和 IL-6表達情況；D.大鼠腦內(nèi)IκBα表達情況；與C組比較，*1P<0.05；與I組比較，*2P<0.05

A-C.expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 in hippocampus of rats; D.IκBα expression in hippocampus of rats；Compared with group C,*1P<0.05; Compared with group I,*2P<0.05

圖3水迷宮實驗后2周4組大鼠海馬內(nèi)IκBα表達情況

Fig.3IκBαexpressioninthehippocampusoffourgroupsofratsafterwatermazetest

綜上所述，LXA4預處理可減輕1.4%異氟烷致老年大鼠認知功能障礙，其機制可能與LXA4降低老年大鼠海馬中促炎細胞因子有關。