Ndfip1對神經細胞鐵超載損傷的保護作用及機制探討

陳明輝，田娟

鐵是腦組織必需的微量元素之一，分布于腦內某些神經元或神經膠質，參與多種生理活動［1］。鐵超載可產生大量羥自由基，對細胞造成氧化應激損傷乃至死亡［2］。目前，大腦鐵穩態調控機制尚不明確。Ndfip1（Nedd4 family interacting protein 1）蛋白是一種進化保守的跨膜蛋白，參與多種蛋白的泛素化降解過程［3］。研究顯示Ndfip1參與調控鐵離子的穩態平衡，但具體作用機制尚無定論［4］。本研究應用Ndfip1質粒轉染人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，觀察鐵超載條件下Ndfip1對神經細胞存活率和鐵代謝的影響，探討Ndfip1對神經細胞的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 SH-SY5Y細胞購于南京科佰生物公司。Ndfip1質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建。兔抗Ndfip1抗體購于美國Sigma公司。小鼠GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（鼠）IgG二抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。PVDF膜和蛋白marker購于美國NEB公司。LipofectamineTM2000轉染試劑、胎牛血清、DMEM/F12培養基和胰蛋白酶購于美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細胞培養 取凍存細胞，放入37℃水浴震蕩快速融化；將細胞懸液吸出置于EP管，并與1 mL的DMEM均勻混合；1 000 r/min離心5 min，去除上清；吸取1 mL DMEM加入EP管，輕柔吸吹，重懸細胞；吸取細胞懸液接種于培養瓶，輕柔搖勻，放入37℃、5%CO2，100%濕度培養箱培養；按時觀察細胞生長狀態，及時置換培養液；細胞密度達到80%傳代培養。

1.2.2 鐵超載濃度測定 將細胞制成懸液，調整細胞密度至1×105/mL并接種于96孔板；當細胞貼壁，將培養液置換成無血清、無抗生素培養液；加入不同濃度（0、10、50、100、200、500 μmol/L）的FeSO4繼續培養24 h；收集各組細胞，每孔加入200 μL MTT，放入37℃、5%CO2、100%濕度培養箱中繼續培養3 h；倒掉培養液，每孔加入200 μL DMSO，在37℃條件下反應10 min；將96孔板放置酶標儀內，測定每孔OD值（波長595 nm），計算細胞存活率，確定實驗最佳的鐵超載濃度。

1.2.3 細胞轉染及分組 將細胞制成懸液，調整細胞密度至2×105/mL，加入12孔板；當細胞貼壁后，替換無血清、無抗生素培養液；細胞繼續培養達70%～80%融合；取1.5 μL LipofectamineTM2000，用無血清、無抗生素培養液稀釋至75 μL，混勻，室溫靜止5 min；取0.6 μg Ndfip1質粒（實驗組）或空質粒（對照組），用無血清、無抗生素培養液稀釋至75 μL，混勻，室溫靜置5 min；將稀釋好的LipofectamineTM2000和Ndfip1質粒（或空質粒）混勻，室溫靜置30 min；將混合液加入12孔板培養細胞的無血清、無抗生素培養液中，置于37℃、5%CO2、100%濕度培養箱中繼續培養4～6 h；將培養液置換為常規培養液，繼續培養至48 h，用于后續實驗。

1.2.4 MTT法檢測SH-SY5Y細胞存活率 將細胞制成懸液，將細胞密度調至1×105/mL并接種于96孔板；當細胞貼壁，將培養液置換成無血清、無抗生素培養液；轉染后繼續培養；各組處理達預定作用時間后，參照1.2.2的步驟計算細胞存活率。

1.2.5 蛋白印跡檢測Ndfip1蛋白表達量 2組細胞經4℃PBS沖洗3次，移至離心管，1 000 r/min低溫離心5 min，棄上清后，加入蛋白裂解液4℃裂解1.5 h，12 000 r/min低溫離心30 min，考馬斯亮藍法對上清液進行蛋白定量。取50 μg待檢測蛋白，加十二烷基磺酸鈉上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶200）4℃震蕩孵育過夜，PBS漂洗3次，辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2 000）室溫震蕩孵育2 h，PBS漂洗3次，應用HRP-ECL蛋白檢測發光，在凝膠電泳圖像分析儀中收集圖像。

1.2.6 Calcein AM法檢測鐵離子 Calcein（鈣黃綠素）可以與鐵結合使其轉換成非熒光物質而使其熒光熄滅，鈣黃綠素的熒光強度與細胞內鐵的含量成反比，熒光弱說明細胞內含鐵量多，提示鐵在不斷的轉入；熒光強說明細胞內含鐵量少，提示鐵轉入減少。將細胞制成懸液，將細胞密度調至1×105/mL后將接種于6孔板；Ndfip1質粒（或空質粒）轉染SH-SY5Y細胞48 h；倒掉培養液，加入含0.5 μmol/L Calcein AM的無血清培養液，培養30 min。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察細胞內鐵離子含量 細胞經過Calcein AM法處理后，棄去培養液，PBS充分漂洗，加入200 μmol/L FeSO4溶液作用10 min，倒置熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.2.8 熒光分光光度計檢測細胞攝入鐵的變化 細胞經過Calcein AM法處理后，棄去培養液，0.25%胰酶消化，PBS充分沖洗，1 000 r/min離心5 min，1 mL PBS懸浮細胞，取500 μL細胞懸液加入比色杯，熒光分光光度計記錄基礎熒光強度，加入FeSO4溶液（終濃度20 μmo/L），熒光分光光度計持續記錄熒光強度（1 800 s），激發波長490 nm，發射波長515 nm。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據統計分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度FeSO4對SH-SY5Y細胞存活率的影響 分別用0、10、50、100、200、500 μmol/L FeSO4處理SH-SY5Y細胞，隨著FeSO4濃度增加，SH-SY5Y細胞存活率逐漸降低。其中，200 μmol/L FeSO4作用下SH-SY5Y細胞存活率明顯降低，差異有統計學意義（F=9.375，P＜ 0.05），見圖1。確定后續實驗鐵超載濃度為200 μmol/L。

Fig.1 Changes of survival rates of SH-SY5Y cells under different concentrations of FeSO4圖1 不同濃度FeSO4作用下SH-SY5Y細胞存活率變化

2.2 Ndfip1質粒轉染效率的測定 Ndfip1質粒轉染SH-SY5Y細胞48 h后檢測細胞內Ndfip1蛋白表達量，以確定Ndfip1質粒的轉染效率。蛋白印跡結果顯示，未轉染組Ndfip1蛋白相對灰度值為0.676±0.021；質粒轉染組Ndfip1蛋白相對灰度值為0.987±0.017，差異有統計學意義（t=7.305，P＜0.01），見圖2。

2.3 Ndfip1過表達對SH-SY5Y細胞存活率的影響 結果顯示，在200 μmol/L FeSO4作用下，實驗組細胞存活率（71.5%±3.1%）明顯高于對照組（62.8%±3.7%），差異有統計學意義（t=5.427，P＜0.05）。

Fig.2 The transfection efficiency of Ndfip1 plasmid圖2 Ndfip1質粒轉染效率

2.4 Ndfip1過表達對SH-SY5Y細胞鐵離子含量的影響 熒光顯微鏡觀察發現，對照組細胞內熒光較弱，實驗組細胞內熒光較強，提示Ndfip1過表達可減少細胞內鐵離子的含量，見圖3。

Fig.3 The fluorescent intensity of two groups of cells(×200)圖3 2組細胞的熒光強度（×200）

2.5 Ndfip1過表達對SH-SY5Y細胞鐵攝入能力的影響 結果顯示，對照組細胞內熒光淬滅的速度較快，而實驗組細胞內熒光淬滅的速度減慢，提示實驗組細胞鐵離子的攝入減少，見圖4。

3 討論

3.1 鐵超載對神經細胞的損傷作用 研究顯示，鐵離子超載對細胞可造成損傷［2］。為驗證其對神經細胞是否適用，本研究分別檢測了0、10、50、100、200、500 μmol/L濃度FeSO4作用下SH-SY5Y細胞存活率的變化。實驗發現，隨著FeSO4濃度不斷增加，SHSY5Y細胞存活率逐漸降低。其中200 μmol/L FeSO4可使細胞存活率明顯下降，說明鐵超載對神經細胞亦存在損傷作用。我們的實驗結果與前人的報道基本一致［5］。

Fig.4 Changes of fluorescence intensity in two groups of cells圖4 2組細胞熒光強度的變化

3.2 Ndfip1對神經細胞的保護作用 進一步實驗證實，Ndfip1質粒轉染后，SH-SY5Y細胞存活率提高，即Ndfip1蛋白過表達可減少鐵超載對神經細胞的損傷作用。換言之，Ndfip1蛋白對神經細胞可能具有一定的保護作用或抗凋亡作用。另有文獻報道，應用不同濃度的CoCl2或FeCl2分別作用于SHSY5Y細胞和人原代培養皮質細胞，結果發現隨著金屬離子濃度的增加，Ndfip1表達上調［6］。由此推測Ndfip1可保護神經元對抗金屬離子的毒性作用。

3.3 Ndfip1的保護作用機制 為明確Ndfip1對神經元的保護作用機制，我們檢測了Ndfip1質粒轉染后，SH-SY5Y細胞內鐵離子含量的變化及鐵攝入能力的改變。結果發現，Ndfip1過表達可減少神經細胞內鐵離子的含量；同時也證實了Ndfip1過表達可減少神經細胞鐵離子的攝入，減少了鐵離子在細胞內的蓄積，減輕鐵超載對神經細胞的損傷，從而提高神經細胞的存活率，發揮其保護作用。但Ndfip1通過何種機制影響鐵的轉入尚不清楚。二價金屬離子轉運蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）是體內唯一的鐵轉入蛋白。文獻報道顯示，Ndfip1與DMT1存在相關性［7］。Foot等［8-9］研 究 發 現 Ndfip1 對DMT1轉運能力具有一定的調控作用。在Ndfip1基因敲除小鼠的肝門靜脈周圍有明顯鐵沉積；在原代培養的Ndfip1-/-小鼠肝細胞內DMT1轉運活性增加；飼以低鐵飲食的Ndfip1-/-小鼠十二指腸上皮細胞DMT1轉運活性增加，表明Ndfip1基因沉默可增強DMT1的轉運活性。Howitt等［10］研究發現Ndfip1能下調DMT1的表達。另有在體實驗證實Ndfip1-/-小鼠肝、十二指腸上皮細胞以及大腦神經元DMT1表達增加［11］。由此推測，Ndfip1在鐵代謝過程中可能具有重要的調控作用。今后，本課題組將進一步關注腦內Ndfip1與鐵調節相關蛋白（如DMT1等）的關系，深入揭示Ndfip1參與腦鐵代謝的機制，為鐵代謝紊亂相關疾病的診斷、治療和預防提供理論依據。