血清RF、anti-CCP及14-3-3η蛋白聯合檢測對類風濕關節炎的診斷價值

楊雅瓊，楊宏偉，白雪，王毅，官士珍

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，患者在發病的2年內即可出現骨關節破壞，造成殘疾和功能障礙。早期診斷和治療是防止關節畸形的關鍵。目前對RA的診斷采用2010年美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）和歐洲抗風濕病聯盟（European League Against Rheumatism，EUIAR）聯合提出的診斷標準（ACR/EULAR 2010標準）［1］，血清學診斷主要為類風濕因子（rheumatoid factor，RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP）、抗角蛋白抗體、抗核周因子等，但仍然有部分患者被漏診或誤診［2-3］。2007年Kilani等［4］在關節炎患者的關節液中檢測到了高水平的14-3-3蛋白。14-3-3蛋白是一種廣泛表達于多種真核細胞內的伴侶蛋白家族，包括β、ε、γ、η、τ、ζ和σ7種亞型，血清和關節液中存在14-3-3γ和14-3-3η兩種亞型，其中后者是主要的亞型［4］。Maksymowych等［5］發現，RA患者血清中14-3-3η水平高于健康對照組和疾病對照組，包括其他關節病、結締組織病和自身免疫病。本文擬探討14-3-3η、anti-CCP、RF相互組合的檢測方案，包括平行試驗（串聯試驗）與系列試驗（并聯試驗）對RA的診斷效能。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2016年12月—2017年9月在天津市天津醫院住院的RA患者，所有患者符合ACR/EULAR 2010標準。記錄患者病史，包括病程、發病及進展情況。拍攝雙手及腕X線片，檢查腫脹關節數（SW28）、觸痛關節數（T28），檢測紅細胞沉降率（ESR）、C反應蛋白（CRP）等指標，計算28個關節的疾病活動性評分（Disease Activity Score 28-joint count，DAS28）。排除嚴重糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、感染、肝腎疾病、腫瘤及其他慢性疾病的患者。患者在確診前均未進行改善病情的抗風濕藥物（disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs）治療。

RA組患者94例，年齡26～87歲，病程0.3～480個月，其中男23例，女71例，平均年齡（60.89±11.47）歲。另選擇骨性關節炎（OA）患者20例、強直性脊柱炎（AS）患者11例，痛風患者9例，為疾病對照組，其中男16例，女24例，平均年齡（56.30±12.89）歲。健康對照組40例，為同期我院體檢健康者，男15例，女25例，平均年齡（58.50±14.62）歲。各組間年齡（F=1.960）、性別（χ2=4.177）差異均無統計學意義（均P＞0.05）。所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 14-3-3η蛋白檢測試劑采用CUSABIO-進口分裝試劑，anti-CCP試劑為德國AESKULISA RA/CP-Detect試劑盒，14-3-3η蛋白及anti-CCP檢測儀器均為TECAN SUNRISE酶標儀。RF檢測所用儀器為BECKMAN COULTER公司IMMAGE 800及其配套試劑。

1.3 檢測方法 受試者于清晨采集空腹靜脈血分別置于含分離膠的真空采血管中，靜脈血標本于3 500 r/min離心15 min，分離血清，用于14-3-3η、anti-CCP及RF的檢測。14-3-3η蛋白及anti-CCP檢測采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法，根據 ROC 曲線，14-3-3η 蛋白≥1.44 μg/L、anti-CCP≥14.12 U/L為陽性，RF采用散射免疫比濁法，RF≥20.05 U/L為陽性。檢測方案根據檢測項目的數量分為單項目組合、雙項目組合、三項目組合。并聯試驗是同時做幾個試驗，其中有一個試驗呈陽性結果，就可以認為有患病的證據；串聯試驗是依次相繼做幾個試驗，只有所有試驗均陽性，才能做出陽性診斷。

1.4 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 17.0對數據進行統計學分析，計數資料的比較采用χ2檢驗。采用四格表計算3種抗體單獨檢測及聯合檢測對RA診斷的效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RF、anti-CCP及14-3-3η檢測各方案陽性率的比較 雙項目組合共有6個方案，三項目組合有9個方案，與單項目一起共有18個方案。將RF、anti-CCP及14-3-3η單一及聯合檢測方案在RA組、疾病對照組、健康對照組及非RA組（疾病對照組和健康對照組）陽性率進行比較，RA組各檢測方案的陽性率與疾病對照組、健康對照組比較均有明顯提高，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 各聯合方案對RA的診斷價值 檢測94例RA患者，40例疾病對照組患者和40例健康對照組血清中3項檢測指標，采用單一及聯合檢測方案分析對RA的診斷效能，發現單項目檢測方案中，anti-CCP的敏感度最高（84.0%），雙項目檢測方案中，14-3-3η與anti-CCP并聯方案的敏感度最高（97.9%），3項目檢測方案中，14-3-3η、anti-CCP與RF并聯方案的敏感度最高（98.9%）。RF、anti-CCP、14-3-3η檢測各方案分析的敏感度、特異度、陽性預測值（PPV）、陰性預測值（NPV）、準確度及約登指數（Youden’s index，YI）見表2。

Tab.1 Comparison of positive rates of single and combined detection of serum RF,anti-CCP and 14-3-3η protein表1 血清RF、anti-CCP及14-3-3η單一及聯合檢測方案陽性率的比較

3 討論

RA患者的血清中存在多種自身抗體［6-7］。RF的敏感度較高，但是特異度較差，在很多其他疾病，如系統性紅斑狼瘡（SLE）、干燥綜合征、脊柱關節病中也會出現，甚至在老年人中也有一定程度的升高。2000年Schetlekens等［8］通過ELISA方法對anti-CCP進行測定發現，anti-CCP對RA（包括早期RA）有高特異度，提示了其在RA預后評價中的價值。2010年anti-CCP被納入ACR/EULAR診斷標準［1］，作為診斷RA的血清學指標。但是仍有部分患者診斷困難，尋找RA相關指標，提高RA診斷的敏感度、特異度，實現早期診斷、早期治療是阻止RA病情發展和降低致殘率的關鍵。

Tab.2 The diagnostic value of single and combined detection of serum RF,anti-CCP and 14-3-3η protein for RA表2 血清RF、anti-CCP及14-3-3η單一及聯合方案對RA的診斷價值

14-3-3蛋白首次發現于牛腦細胞中，有200多種蛋白能夠與14-3-3蛋白結合，其參與了細胞凋亡、細胞信號轉導、蛋白跨膜轉運、環境應答、細胞分裂等領域［9-11］。2007年Kilani等［4］發現在炎性關節疾病患者的關節液和血清中14-3-3蛋白的η和γ 2個亞型增高顯著，以η亞型為主，且14-3-3η蛋白水平與基質金屬蛋白酶（MMP）-1和MMP-3顯著相關，說明14-3-3η很可能與關節損傷有關。另外，關節液中14-3-3η水平比血清中高出5倍，說明這種生物標志物可能源于滑膜。Maksymowych等［12］使用與RA患者血清水平相當的14-3-3η蛋白可激活關鍵細胞信號級聯反應，導致促炎細胞因子以及與關節損傷過程相關因子的轉錄。Maksymowych等［5］和Carrier等［13］報道14-3-3η與疾病嚴重程度有關。在多因素研究中，14-3-3η可作為預測RA病情進展的獨立因子［14-15］。另有研究報道，14-3-3η可作為RA患者出現骨質疏松的預測指標［16］。

目前對RA的管理標準已經上升到早期診斷并阻止關節痛發展為明顯的RA。所以實驗室診斷指標需特別注重敏感度，同時兼顧特異度。本研究中，臨界值的界定采用ROC曲線法，選擇“敏感度+特異度”最高時的值作為臨界值。其中anti-CCP的臨界值為14.12 U/L，與試劑說明書給出的參考區間（0～12 U/L，12～18 U/L為灰區）基本一致；RF的臨界值為20.05 U/L，與試劑說明書給出的參考區間（0～20 U/L）一致；14-3-3η蛋白的臨界值為1.44 μg/L，這個指標尚未應用于臨床，說明書未給出參考區間，國外文獻報道的臨界值為 0.19 μg/L［5］，國內文獻臨界值有的采用0.721 μg/L［17］，有的采用2.59 μg/L［18］，可能與所用的試劑盒不同有關。根據本研究得出的臨界值，各檢測方案在RA組與非RA組，RA組與疾病對照組、RA組與健康對照組之間比較，陽性率差異均有統計學意義（P＜0.05），說明這些方案對于RA的診斷均有一定價值。在單一指標檢測時anti-CCP的準確度及約登指數均比RF和14-3-3η高，在RA的診斷中具有突出的價值，與之前的研究結果一致［18-20］。兩項目聯合時，anti-CCP無論與RF并聯還是與14-3-3η并聯均可提高敏感度，但與RF并聯時特異度較好，準確度及YI最高，是較為理想的項目組合。當采用anti-CCP、RF和14-3-3η三項目組合時，方案3.2、3.3、3.9的準確度和YI較高，同時又有較高的敏感度，是比較理想的組合方案。

總之，為了提高RA患者的早期診斷率，在條件允許的情況下，最好對3種指標進行聯合檢測。如果選擇單項目方案，anti-CCP的敏感度、特異度、準確度、YI均最高，是最好的指標；如果選擇雙項目組合，anti-CCP和RF仍為較理想的項目組合，尤以兩者并聯方案為佳，可獲得較高的準確度和YI。三項目組合中方案3.2、3.3、3.9的準確度和YI較高，同時又有較高敏感性，是較為合理的組合方案，對RA的診斷有較好的臨床價值。