枯草芽孢桿菌芽孢皮層裂解酶CwlJ基因的克隆及酶生物信息學分析

馬慧嬌，曾朝瑋，郭洪偉，郭家俊，章 中*

（寧夏大學 農學院，寧夏 銀川750021）

細菌芽孢對殺菌處理的極端抗性，是造成食品安全問題和食品腐敗的重要原因[1]。芽孢極端抗性與其特有結構息息相關，其從外到里有七層結構，分別是孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、細胞壁、內膜、核心[2]。芽孢皮層是維持芽孢休眠狀態的關鍵結構，主要由肽聚糖構成，是芽孢抗壓性的一層關鍵結構。在芽孢萌發而轉變成營養體的過程中，皮層裂解酶可將芽孢皮層水解，使得芽孢失去休眠特性[3-6]。皮層裂解酶是芽孢所特有的專一水解皮層肽聚糖的酶，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中有許多皮層裂解酶同系物的存在，CwlJ就是其中之一[7-8]。

高壓熱殺菌技術（high-pressure thermal sterilization，HPTS）是一種新興食品加工技術，該技術利用壓力和溫度的協同效應，可有效殺滅芽孢，并較好地保持食品的營養和感官品質[9-10]。前期研究發現HPTS下芽孢皮層肽聚糖發生了水解，有報道推測HPTS可能激活了皮層裂解酶而導致皮層肽聚糖水解[11-12]，那么證實推測并了解其水解機理就成為關鍵。

本研究對克隆所得的CwlJ基因采用美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）和ExPASy等網站中的各種信息分析工具，并結合DNAMAN軟件對其理化性質、親/疏水性、二級結構、三級結構、可溶性等進行生物信息預測和分析。該分析結果在揭示皮層裂解酶CwlJ結構與性質的同時，也為后續皮層裂解酶CwlJ的表達、分離純化以及闡明HPTS下皮層肽聚糖水解機理奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 化學試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）As1.433：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC）；pET-28a（+）、DH5α：生工生物工程（上海）上海股份有限公司；DNA分子質量標準、核酸染料、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、普通質粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產品；限制性核酸內切酶、連接酶：英國NEB公司；胰蛋白胨、酵母提取物：英國OXOID公司；瓊脂粉、氯化鈉：北京化學試劑公司產品；卡那霉素：上海求德生物化工有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.2 培養基

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉5 g/L，用1 mol/L NaOH溶液調pH值為7.0。LB固體培養基是在LB液體培養基中加入15 g/L的瓊脂粉。培養基的滅菌條件均為121 ℃、20 min。

1.2 儀器與設備

AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DSX-280B型高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；LRH系列生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州潔凈技術研究所；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽：北京六一儀器廠；T100型梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel doc2000型凝膠成像儀：美國BIO-RAD公司；HH·SY21-Ni恒溫水浴器：北京長源實驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 皮層裂解酶CwlJ基因的克隆

依據在蛋白質數據庫UniProtKB中搜索到的來自Bacillus subtilis-P42249的皮層裂解酶CwlJ的氨基酸序列，通過NCBI序列比對獲得CwlJ的基因序列。由基因序列設計全長引物，其上游引物序列為YA0079-1N（5'-GACACCCATGGGCATGGCG-3）'；下游引物序列為YA0079-20N（5'-GTGTCCTCGAGAAATGTGTT-3）'（下劃線部分分別為限制性核酸內切酶NcoI、XhoI的識別位點），按照95 ℃預變性3 min；95 ℃變性22 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，24個循環；72 ℃再延伸5 min的PCR反應體系進行CwlJ全基因合成。合成產物CwlJ進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用回收試劑盒對目的條帶進行切膠回收和純化。對質粒pET-28a（+）和目的基因CwlJ同時使用NcoI和XhoI進行雙酶切后用T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜，連接產物轉化至DH5α感受態細胞，并涂布在含100 g/mL卡那霉素的LB固體培養基上，37 ℃培養過夜，篩選陽性克隆質粒進行雙酶切鑒定，并送至昆泰銳武漢生物技術有限責任公司進行菌液測序。

1.3.2 皮層裂解酶CwlJ生物信息學分析

測序結果經translate工具轉換得到CwlJ基因編碼的蛋白序列，與蛋白數據庫中目標序列比對后完全一致。利用ProtParam程序對CwlJ基因編碼的蛋白質進行理化性質分析；軟件SOPMA對皮層裂解酶CwlJ進行螺旋卷曲分析；SWISS-MODEL對該酶進行三維結構預測；DNAMAN軟件對該酶的親、疏水性和系統進化進行分析；TMHMM工具分析該酶是否有跨膜結構；SignalP軟件分析該酶是否為分泌蛋白；TargetP工具對該酶進行亞細胞定位預測[13-14]；Harrison統計學模型預測該酶的可溶性。

2 結果與分析

2.1 皮層裂解酶CwlJ基因的克隆

根據已知CwlJ氨基酸序列，合成目的基因CwlJ。合成產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。由圖1可知，所得產物大小約為450 bp，目的條帶上方出現的陰影可能是引物不特異或者退火溫度不合理等原因造成的。

圖1 CwlJ基因PCR擴增產物電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of PCR amplification product of CwlJ gene

目的基因CwlJ克隆至質粒pET-28a（+）后的雙酶切驗證，結果見圖2。由圖2可知，顯示所切掉的片段和克隆序列大小一致，可確定CwlJ基因已經插入質粒pET-28a（+）中。

圖2 雙酶切鑒定結果Fig. 2 Results of double enzyme digestion identification

測序結果見圖3。由圖3可知，該克隆基因全長440 bp，與克隆序列一致，且開放閱讀框架正確。由此得出結論pET-28a（+）-CwlJ重組載體構建成功[15]。

圖3 克隆基因CwlJ的測序峰圖Fig. 3 Sequencing peak map of cloned gene CwlJ

2.2 皮層裂解酶CwlJ生物信息學分析

2.2.1 皮層裂解酶CwlJ一級結構及其理化性質分析

表1 皮層裂解酶CwlJ氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of cortex lytic enzyme CwlJ

運用ProtParam程序在線分析芽孢皮層裂解酶CwlJ的理化特性，結果表明皮層裂解酶CwlJ的理論分子質量為16.462 kDa，理論等電點為9.54，原子總數共2 276個，分子式為C731H1116N218O203S8；該酶的親水性平均系數（grand average of hydropathicity，GRAVY）值為-0.506，GRAVY值通常可以用來表征蛋白質的親/疏水性，其范圍一般在-2～2之間，疏水蛋白的GRAVY 值為正值，親水蛋白的GRAVY值則為負值，所以皮層裂解酶CwlJ為親水蛋白；該酶的不穩定系數為42.20，當蛋白質不穩定系數＞40時，蛋白不穩定[16]，說明CwlJ為不穩定蛋白；CwlJ共編碼142個氨基酸（見表1），其中含量最高的是丙氨酸（Ala）和精氨酸（Arg），共占氨基酸總含量的22.6%，含量最低的是色氨酸（Trp）和組氨酸（His），兩種氨基酸所占比例相同，各為2.1%，帶負電的氨基酸殘基總數（Asp+Glu）為13個，帶正電的氨基酸殘基的總數（Arg+Lys）是20個。

2.2.2 皮層裂解酶CwlJ的二級結構分析

軟件SOPMA可以正確預測蛋白二級結構，結果見圖4。由圖4可知，蛋白二級結構中α-螺旋占26.06%，β-折疊占21.83%，β-轉角占4.93%，無規則卷曲占47.18%。

圖4 皮層裂解酶CwlJ二級結構分析Fig. 4 Analysis of secondary structure of cortex lytic enzyme CwlJ

2.2.3 皮層裂解酶CwlJ的三級結構預測

SWISS-MODEL建模預測所得皮層裂解酶CwlJ三級結構圖見圖5。

圖5 皮層裂解酶CwlJ三級結構預測Fig. 5 Prediction of tertiary structure of cortex lytic enzyme CwlJ

2.2.4 皮層裂解酶CwlJ的親/疏水性分析

采用DNAMAN 程序軟件分析皮層裂解酶CwlJ的親、疏水性，結果見圖6。由圖6可知，皮層裂解酶CwlJ的親、疏水性分值越高表明疏水性越強，分值越低表明親水性越強。分析結果顯示疏水性最強的區域為第30～35個氨基酸附近，親水性最強的區域為第95～104個氨基酸附近，經預測該酶的氨基酸大多都是親水性較強，這也進一步證實了ProtParam程序預測該酶為親水蛋白的結果。

圖6 皮層裂解酶CwlJ的氨基酸疏水性（A）和親水性（B）分析Fig. 6 Hydrophobicity (A) and hydrophilicity (B) analysis of amino acid of cortex lytic enzyme CwlJ

2.2.5 皮層裂解酶CwlJ的跨膜區分析

借助Expasy中的TMHMM工具對蛋白是否含膜蛋白進行預測。結果見圖7。

圖7 皮層裂解酶CwlJ的跨膜區預測Fig. 7 Prediction of transmembrane region of cortex lytic enzyme CwlJ

由圖7可知，蛋白質序列的長度為142，預測的跨膜螺旋數為0；預期的膜內螺旋氨基酸數量為0.006 44；蛋白質的前60個氨基酸跨膜螺旋中預期的氨基酸數量為0.002 08；蛋白質N端在細胞膜內的可能性為0.340 59。如果outside與inside兩條線存在相交，則相交的部分為跨膜區。圖中這兩條線是平行不相交的，因此不存在跨膜區。通常預期的膜內螺旋氨基酸數量如果數目＞18，則很可能該酶是跨膜蛋白，但本研究結果0.006 44明顯＜18，所以該酶無跨膜區，說明該酶不可能作為膜受體起作用，也不可能是膜錨定蛋白或離子通道蛋白。

2.2.6 皮層裂解酶CwlJ的信號肽分析

應用SignalP預測CwlJ編碼的氨基酸序列中是否存在信號肽[17-18]。根據預測的蛋白質來源選擇革蘭氏陽性菌。結果見圖8。

圖8 皮層裂解酶CwlJ的信號肽分析Fig. 8 Signal peptide analysis of cortex lytic enzyme CwlJ

由圖8可知，S-mean是從N端氨基酸開始到剪切位點處各氨基酸的平均值；D值是S-mean和Y-max的平均值，其對區分是否為分泌蛋白具有重要作用，對于非分泌蛋白，該行輸出的分數值非常低（接近目標值0.1）。預測結果中，信號肽（SP）結果為No，且D值非常接近0.1，說明CwlJ沒有信號肽，且不是分泌蛋白。

2.2.7 皮層裂解酶CwlJ的亞細胞定位

通過TargetP工具對CwlJ進行亞細胞定位預測。結果見表2。

表2 亞細胞定位預測Table 2 Subcellular location prediction

由表2可知，mTP值越接近1.0，表明蛋白質位于線粒體的可能性越大；SP值越接近1.0，表明有信號肽。其他表明蛋白很有可能位于其他地方。除此之外，其數值范圍從1到5，其中RC值越小，說明預測的可靠性越高，本次預測RC值為2，表明可靠性相對較高。結果表明，CwlJ位于線粒體的可能性僅為11.5%，位于其他地方的可能性更大，具體定位地方不確定，且含有信號肽的可能性極低，這也進一步驗證了2.2.6的預測結果。

2.2.8 皮層裂解酶CwlJ重組蛋白的可溶性分析

參照WILKINSON D L等[19]兩參數預測模型，預測重組蛋白的可溶性。判斷的標準值（criterion of values，CV）及概率（probability，P）計算公式如下：

式中：CV 為判斷的標準值；CV'為校準值，其為1.71；N、P、G、S、R、K、D、E分別代表天門冬酰胺、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸的數量，個；n代表CwlJ序列中全部氨基酸殘基的數量，個。

CV-CV'值可用來判斷CwlJ基因在大腸桿菌中進行可溶性表達的傾向。如果CV-CV'＜0，則該基因有可溶性表達的傾向；如果CV-CV'＞0，則該基因在表達時更傾向于形成包涵體；CV-CV'的絕對值越大，傾向性越明顯[20]。可溶性（或不可溶性）P則是在體現該可能性的大小。通過計算，該酶中CV-CV'值約為0.76＞0，表明CwlJ基因在表達時易形成包涵體，且其概率P為68.11%，預測重組蛋白可溶性可能性較大。

2.2.9 來自不同菌種的皮層裂解酶CwlJ的系統進化分析

用DNAMAN軟件對來自不同菌的皮層裂解酶CwlJ構建系統進化樹進行同源序列聚類分析，結果見圖9。

圖9 皮層裂解酶CwlJ系統進化樹Fig. 9 Phylogenetic tree of cortex lytic enzyme CwlJ

由圖9可知，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）皮層裂解酶CwlJ與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）CwlJ、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）Bt18247 CwlJ處于同一個小分支，表明在進化過程中距離最近，親緣關系最為密切；與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）CwlJ、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）CwlJ、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）CwlJ、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）CwlJ、類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.P22）CwlJ同屬一個大分支，表明其具有較高的同源性，反之則親緣關系較遠。

3 結論

通過克隆得到基因CwlJ，其編碼142個氨基酸，基因全長為440 bp。而且測序和雙酶切結果均表明重組表達載體pET-28（+）-CwlJ構建成功，為后期表達純化CwlJ奠定了基礎。

生物信息學各軟件分析結果表明：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）皮層裂解酶CwlJ是一個分子量大小為16.462 kDa，親水性的堿性不穩定蛋白；二級結構分析表明α-螺旋占26.06%，β-延伸鏈占21.83%，β-轉角占4.93%，無規則卷曲占47.18%；DNAMAN 程序分析得該酶多以親水性氨基酸存在，為親水蛋白；TMHMM程序分析得CwlJ不是分泌性蛋白；亞細胞定位顯示在所預測范圍內存在的可能性較小，可能位于其他地方；可溶性預測分析得知表達的酶蛋白傾向于形成包涵體，可能性為68.11%；系統進化分析表明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）皮層裂解酶CwlJ與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）皮層裂解酶CwlJ、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）Bt18247皮層裂解酶CwlJ親緣關系較近。

克隆表達載體pET-28a（+）-CwlJ構建成功，且通過生物信息學分析，了解了皮層裂解酶CwlJ的組成和結構特性，為后續皮層裂解酶CwlJ大批量異源表達、酶學性質與功能的研究提供了參考信息。