單寧酸和綠原酸對楊梅花色苷的輔色作用

樓樂燕，岳陽，尹培，陳健初，葉興乾，劉東紅

(浙江大學 生物系統工程與食品科學學院,浙江 杭州，310058)

植物來源的花色苷是一種具有良好應用前景的天然著色劑[1]，具有抗氧化[2]、抗炎[3]、清除自由基[4]、抗腫瘤[5-6]等生理活性功能。花色苷極不穩定，在食品加工和貯藏過程中容易受到外界因素如溫度、pH、光照、氧氣等影響而發生降解，生成無色的查爾酮或其同分異構體α-二酮[7]。目前用來提高花色苷穩定性的途徑主要有：分子輔色(copigmentation)作用、化學結構修飾、生物工程技術等[8]。其中輔色作用的原理是模擬自然生化條件下植物中花色苷的穩定呈色機制[9]，故近年來備受研究學者的關注。

花色苷的輔色作用方式有分子內或分子間輔色、金屬絡合和自聚合作用4種，常用的輔色劑有酚類化合物、生物堿、金屬離子以及有機酸等[10]，其中以酚類化合物如類黃酮、酚酸等研究最多[11]。盧鋒波[12]研究發現在模擬酒體系和黑莓汁體系中，阿魏酸、咖啡酸和綠原酸對黑莓花色苷產生了增色和紅移效應，并且在輔色過程中產生了衍生物。李永強等[13]研究黃酮對楊梅花色苷的輔色作用發現黃酮含量與楊梅酒的色調角、最大吸收波長和花色苷含量呈極顯著正相關關系。劉松等[14]研究發現單寧酸對黑米色素、紅樹莓色素和甘藍紅色素3種物質中提取的天然色素都有輔色效果。ZHANG等[15]研究發現羥基肉桂酸類化合物處理的紅葡萄酒模擬溶液在pH 3.6的環境下表現出明顯的紅移和增色效應。楊梅雖顏色鮮艷，富含花色苷，但楊梅汁等加工制品在加工過程中容易因花色苷的不穩定而失去美觀色澤。而有關提高楊梅花色苷在水溶液體系下的穩定性研究報道較少，并且類黃酮物質大多不溶于水無法作為輔色劑添加到楊梅花色苷水溶液體系中，故選用單寧酸和綠原酸2種水溶性較好的酚酸作為輔色劑，探究其對增強楊梅花色苷水溶液體系下的穩定性效果的研究意義重大。

本研究以實驗室自提的楊梅花色苷為研究對象，選取單寧酸和綠原酸為輔色劑，在pH 3.4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液體系下研究不同摩爾濃度的輔色劑對輔色效果的影響，探究輔色劑對楊梅花色苷熱降解及色澤穩定性的影響，通過熱力學研究探討輔色反應的過程，分析輔色前后楊梅花色苷組分變化，初步探討單寧酸和綠原酸對楊梅花色苷的輔色機理。以期為楊梅衍生產品實際生產過程中花色苷穩定性的提高提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺種楊梅采自浙江寧波慈溪，立即冷藏至-18 ℃冰箱。

綠原酸95%、單寧酸、甲醇(色譜級)、甲酸(色譜級)，中國上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Na2HPO4、檸檬酸、HCl、乙醇(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；純凈水，中國杭州娃哈哈集團有限公司；矢車菊素-3-葡萄糖苷(純度≥95%)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

HH-10數顯恒溫攪拌水浴鍋，金壇市科杰儀器廠；UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；Color Flex EZ全自動色差計，美國Hunt Lab顏色管理公司；浴室超聲波裝置，寧波新芝生物科技股份有限公司；Waters2695 高效液相色譜系統(配有可變光波長紫外檢測器和Empower色譜工作站)，美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 楊梅花色苷模擬溶液的制備

楊梅花色苷的提取參考劉傳菊[16]的方法稍作修改，稱取50 g冷凍干燥的楊梅(去核)，加入500 mL含有0.1%HCl的60%乙醇溶液，超聲提取3 h，過濾，濾渣再用500 mL含有0.1%HCl的60%乙醇溶液超聲提取3 h，過濾、合并所得濾液。花色苷澄清液再用旋轉蒸發儀濃縮(溫度<40 ℃)至約50 mL，并回收乙醇。將上述花色苷濃縮液用pH 3.4的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液稀釋200倍得到楊梅花色苷樣品溶液，避光放置備用。

1.3.2 輔色作用實驗

1.3.2.1 輔色劑濃度對楊梅花色苷色澤的影響

取楊梅花色苷模擬溶液，分別加入單寧酸和綠原酸，花色苷與輔色劑的摩爾比為1∶0、1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30，混合均勻。置于80 ℃水浴鍋中加熱2 h后取出，測定相關指標測定。

1.3.2.2 輔色劑對楊梅花色苷熱穩定性的影響

取楊梅花色苷樣品溶液，分別加入單寧酸和綠原酸，花色苷與輔色劑的摩爾比為1∶20混合均勻。分別置于70，80，90 ℃水浴鍋中加熱5 h，每隔1 h取樣進行相關指標測定。

1.3.3 可見吸收光譜及色差的測定

可見吸收光譜采用紫外-可見分光光度計進行測定。取樣品溶液3 mL，在400～700 nm處進行高速掃描，掃描間隔為1 nm，以蒸餾水為參比，比色皿長度為1 cm。

色差采用全自動色差儀直接測定。于反射模式下測定樣品的CIELAB三刺激顏色L*a*b*值，重復3次[17]。L*從100到0表示由白色變為黑色，a*由小到大代表顏色從綠變紅，b*由小到大代表顏色從藍變黃。將色差值用Photoshop軟件還原成色塊，做成直觀的顏色圖[18]。

1.3.4 熱力學數據分析

輔色作用的熱力學數據參考MALAJ等[19]的方法計算，并稍作修改。

1.3.4.1 平衡常數K

根據方程ln[(A-A0)/A0]=lnK+nln[Cp]0，進行直線擬合求出K值。A和A0分別為添加不同濃度的輔色劑和未添加輔色劑的花色苷溶液在80 ℃下加熱2 h后的512 nm處吸光值；n為輔色劑與花色苷的化學計量比；[Cp]0為輔色劑的濃度。

1.3.4.2 吉布斯自由能ΔG

根據方程ΔG=-RTlnK計算吉布斯自由能ΔG值。其中R為氣體摩爾常數(8.314 J/(mol·k))

1.3.4.3 焓變值ΔH

1.3.4.4 熵變值ΔS

根據Gibbs-Helmholtz方程ΔG=ΔH-TΔS計算ΔS值。

1.3.5 楊梅花色苷輔色前后HPLC分析

參考TIWARI等[20]的方法并稍作修改，液相條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A相為5%甲酸水溶液，B相為純甲醇，洗脫程序0～5 min： 5%B，5～8 min:5%～25%B；8～15 min： 25%～30%B；15～20 min：30%～5%B；檢測波長520 nm；流速為1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.6 統計分析

每個樣品設置3個平行，采用Excel和SPSS軟件進行比較分析。測定結果以平均值±標準差表示。實驗數據采用ANOVA進行鄧肯氏(Duncan’s)差異分析，以P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 輔色劑對楊梅花色苷的輔色效果

2.1.1 輔色劑濃度對楊梅花色苷色澤的影響

由圖1可知，隨著輔色劑濃度的增大，楊梅花色苷溶液的最大吸光值逐漸升高，輔色效果逐漸增強。以不加輔色劑的花色苷溶液為空白對照，當花色苷與輔色劑的摩爾比為1∶1時，單寧酸和綠原酸輔色組的最大吸光值與空白組相比差異均不顯著(P>0.05)；當摩爾比為1∶5時，單寧酸輔色組的最大吸光值與空白組相比差異顯著(P<0.05)，而此時綠原酸輔色組與空白組相比差異仍不顯著；當摩爾比≥1∶20時，單寧酸和綠原酸輔色組的最大吸光值與空白組相比均差異顯著(P<0.05)。由圖1可以看出，花色苷溶液的最大吸收波長隨著花色苷與輔色劑摩爾比的增大而發生遷移。當摩爾比從1∶0增加到1∶30時，單寧酸輔色組的最大吸收波長從512 nm遷移到522 nm，而綠原酸組從512 nm遷移到515 nm，都出現了紅移現象，說明單寧酸和綠原酸都能使花色苷產生增色效應，濃度越大，增色效應越明顯。

a-輔色劑為單寧酸；b-輔色劑為綠原酸圖1 楊梅花色苷溶液加入不同摩爾比的單寧酸和綠原酸輔色時的紫外掃描圖Fig.1 The UV-vis of bayberry anthocyanins solution when added with different molar ratio of tannic acid and chlorogenic acid

表1 楊梅花色苷溶液加入不同摩爾比的單寧酸和綠原酸輔色時的L*、a*、b*值Table 1 Changes of L*,a*,b* values of bayberry anthocyanins solution when added with different molar of tannic acid and chlorogenic acid

注：同一列相同字母代表差異不顯著，不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

由表1可知，經單寧酸和綠原酸輔色后，楊梅花色苷溶液的L*值減小，a*值增大，說明楊梅花色苷溶液的顏色變深、紅度增加。以不加輔色劑的花色苷溶液為空白對照，當花色苷與輔色劑的摩爾比≥1∶5時，單寧酸輔色組的L*值、a*值與空白組相比差異顯著(P<0.05)；當摩爾比≥1∶20時，綠原酸輔色組的L*值、a*值與空白組相比差異顯著(P<0.05)，L*值、a*值的差異變化與最大吸光值的結果一致。b*值隨著摩爾比的增加無明顯變化趨勢。楊梅花色苷輔色后L*值、a*值的變化趨勢與劉松等[14]研究單寧酸對甘藍紅色素、黑米色素和紅樹莓色素的輔色作用結果一致。

2.1.2 輔色劑對楊梅花色苷溶液色澤熱穩定性的影響

如圖2所示，楊梅花色苷溶液及加入輔色劑輔色后的楊梅花色苷溶液吸光值均隨著加熱溫度的升高和時間的延長呈降低趨勢。對照組在70、80、90 ℃條件下加熱5 h后吸光值分別下降至0.605、0.455、0.240， 與加熱前相比，分別降低了22.5%、41.7%、69.3%。用單寧酸、綠原酸輔色后的花色苷溶液在70 ℃、80 ℃加熱5 h后，吸光值分別下降至0.800、0.678 和0.637、0.532。

圖2 楊梅花色苷溶液經輔色后A512值隨著加熱時間的變化Fig.2 Changes of A512value of bayberry anthocyanins solution after copigmentation with time

90 ℃加熱5 h后，吸光值分別為0.370、0.297，與加熱前相比，吸光值分別降低了62.7%和65.9%。加熱后，輔色組吸光值的下降速率均小于對照組，說明經單寧酸和綠原酸輔色后，楊梅花色苷色澤穩定性明顯提高，且2種酚酸的輔色效果在不同溫度下對于熱穩定性的提高有所差異，單寧酸的輔色效果優于綠原酸。

由圖3可知，在熱處理過程中，楊梅花色苷溶液的L*值隨加熱時間的延長呈上升趨勢，a*值、b*呈下降趨勢，表明在加熱條件下，溶液的亮度變小，紅色度降低。在70、80、90 ℃下，對照組的a*下降速度最快，綠原酸輔色組次之，單寧酸輔色組下降速度最慢。90 ℃加熱5 h后，對照組、單寧酸組和綠原酸組的a*值分別從44.58、51.26、47.62下降至19.84、33.33、25.25。說明在加熱過程中，2種輔色劑均可減緩楊梅花色苷溶液色澤的降解速率，且單寧酸的輔色效果較綠原酸好。這與吸光值分析的結果一致。

圖4是用Photoshop軟件以色差值制作的色塊圖。由圖4中可以直觀地觀察到熱處理下未添加輔色劑和添加輔色劑的楊梅花色苷溶液的顏色變化。隨著加熱時間的延長，楊梅花色苷溶液顏色變淺，紅色度降低，褐色度增加。其中，90 ℃處理下顏色變化最劇烈，輔色效果也最為凸顯，80 ℃次之，而70 ℃下較難用肉眼識別變化。在加熱5 h后，單寧酸輔色后的還原色塊紅色度相比對照明顯偏高。說明單寧酸的輔色效果較好，對增強花色苷溶液的熱穩定性有明顯作用。

圖3 楊梅花色苷溶液經輔色后L*、a*、b*值隨著加熱時間的變化Fig.3 Changes of L*,a*,b* values of bayberry anthocyanins solution after copigmentation with time

a-對照組；b-單寧酸輔色組；c-綠原酸輔色組，色塊從左至右分別為未加熱、加熱1 h、2 h、3 h、4 h、5 h的樣品圖4 楊梅花色苷溶液經輔色后還原色塊圖隨著加熱時間的變化Fig.4 Changes of color swatches of bayberry anthocyanins solution after copigmentation with time

2.2 輔色作用機理的初步探究

2.2.1 楊梅花色苷輔色前后的組分分析

楊梅花色苷經單寧酸和綠原酸輔色前后的液相色譜圖如圖5所示，楊梅花色苷水溶液體系下輔色處理組均無衍生物產生，與對照組花色苷組分一致。早前有學者認為[21-22]，有機酸可與花色苷上的糖鏈發生酰化反應形成酰基化的花色苷，花色苷有效保護花色苷母核的陽離子免受水分子的親核攻擊，進而提高花色苷的穩定性。本實驗中未發現輔色組有新的花色苷衍生物產生，故可判斷單寧酸和綠原酸的輔色作用并非由于酰化反應造成。ZHANG等[23]在研究紅葡萄酒模擬溶液中研究多酚物質對錦葵色素-3-葡萄糖苷的輔色作用時，通過量子力學計算推測兩者之間的輔色作用是非共價結合的結果，是因為π-π堆疊形成更穩定的復合物來提高花色苷的穩定性。據此推測單寧酸和綠原酸與楊梅花色苷的輔色作用也可能是非共價輔色。

a-對照組；b-單寧酸輔色組；c-綠原酸輔色組圖5 楊梅花色苷添加輔色劑前后液相色譜圖Fig.5 HPLC profiles of bayberry anthocyanins before and after copigmentation

2.2.2 輔色作用的熱力學研究

熱力學研究的目的是確立一個判斷標準，判定反應發生的可能性或者反應是否能自發進行[24]。通過計算平衡常數K、吉布斯自由能ΔG、焓變值ΔH、熵變值ΔS來預測花色苷與輔色劑之間的反應、結合等能量交換過程，進而了解輔色反應的機制。根據ln[(A-A0)/A0]與ln[Cp]0進行直線擬合的截距求出K值、ln[(A-A0)/A0]與溫度的倒數(1/T)進行擬合的斜率求出焓變值ΔH，再通過公式進一步計算得出吉布斯自由能ΔG、熵變值ΔS。結果如表2所示所示。

表2 單寧酸和綠原酸與楊梅花色苷輔色作用的平衡常數及熱力學參數Table 2 The equilibrium constant and thermodynamic parameters related to the process of copigmentation among tannic acid,chlorogenic acid and bayberry anthocyanin

輔色作用中花色苷與輔色劑間關聯的強度由平衡常數K值反映[25]，如表2所示，不同的輔色反應體系K值不同，單寧酸輔色組的K值大于綠原酸組，表明單寧酸更容易與楊梅花色苷結合發生輔色反應，這與輔色效果的結論一致。造成輔色效果有所差異的原因可能是2種輔色劑的結構不同[26]，其中單寧酸是沒食子酸的聚合體，而綠原酸是咖啡酸和奎寧酸的酯化物[27]。吉布斯自由能ΔG被看做影響反應過程的熱力學勢能，ΔG小于0，表明輔色反應的過程是自發進行的。焓變值ΔH取決于反應環境的溫度[24]，對于單寧酸和綠原酸與花色苷的輔色反應體系，ΔH均小于0，說明2種輔色劑與花色苷的相互作用的過程均是放熱的，熵變值ΔS小于0，表示反應體系的均勻度降低[28]。

3 結論

在水溶液體系中，2種輔色劑(單寧酸和綠原酸)對于楊梅花色苷均有輔色效果。隨著輔色劑摩爾濃度的增加，楊梅花色苷溶液出現了紅移和增色效應，最大吸光值逐漸增加；在相同摩爾濃度下，單寧酸的增色效果大于綠原酸。添加輔色劑后，楊梅花色苷溶液的熱穩定性提高，與對照組相比，輔色組的A512、L*、a*、b*值的變化速率減緩，顏色變化速率減小。花色苷輔色前后的高效液相色譜圖說明輔色反應過程并無新的花色苷衍生物產生，故排除酰基化反應的作用機理。熱力學研究結果表明：2種輔色作用的吉布斯自由能ΔG值均小于0，表明輔色作用為自發進行的反應；而焓變值ΔH及熵變值ΔS都是負值，表明輔色作用為放熱反應。單寧酸與花色苷輔色反應的平衡常數K值大于綠原酸，說明單寧酸與花色苷的輔色反應更容易進行。關于酚酸分子結構與輔色效果的關系及輔色機理還有待進一步深入探究。

因此，在楊梅花色苷溶液中添加適量單寧酸和綠原酸是提高溶液色澤穩定性的有效方法，且單寧酸的輔色效果大于綠原酸。此外，單寧酸和綠原酸都是水果、蔬菜和谷物中的酚類物質，安全性高于化學合成的輔色劑，且具有多種生物活性，將其開發成天然植物輔色劑具有重大的實際意義。