紅景天苷對急性腦出血大鼠神經功能缺損評分與腦含水量的影響及其作用機制研究

，，，

腦出血(ICH)是一種發病急，病情危重的疾病，其致殘率和致死率非常高，嚴重影響人類的健康和生存質量。腦出血后再血腫形成過程中以及形成后，均存在水腫和炎癥反應，對腦組織造成了進一步的損傷[1]。目前腦出血治療缺乏有效手段，臨床上主要采用降顱壓、神經營養藥物或者手術清除血腫等方式，但是由于腦出血后血腫周圍組織損傷機制尚未清晰，所以尚未有特異的治療方法。

紅景天苷是中藥紅景天中最重要的有效成分之一。近年來人們對紅景天進行了廣泛的研究，發現其具有多種藥理作用，如抗疲勞，防癌，促進血液循環，清除體內毒素等[2]。國內學者研究發現，紅景天苷能夠增加缺血腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)的含量，加速清除超氧陰離子自由基，降低脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的含量，具有減輕缺血腦組織乳酸中毒的作用[3]。本研究通過建立腦出血大鼠模型，研究紅景天苷對腦出血大鼠腦組織是否具有保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，雄性，SPF級，體重230～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于恒溫恒濕環境中，常規飼料，自由飲水進食，晝夜各12 h，進行適應性飼養1周。

1.2 實驗試劑 紅景天苷(Salidroside)購自上海晶都生物技術有限公司；髓過氧化物酶(MPO)活性測定試劑盒購自Sigma-Aldrich公司；缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)與血管內皮生長因子(VEGF)抗體購自Santa cruz公司；β-actin抗體購自碧云天技術公司。

1.3 實驗分組 按隨機數字表法將大鼠分為5組，每組15只。假手術組(Sham)、腦出血組(ICH)、藥物低劑量組(Sal-L)、藥物中劑量組(Sal-M)和藥物高劑量組(Sal-H)。建立腦出血大鼠模型成功后，藥物低劑量組、藥物中劑量組和藥物高劑量組分別給予紅景天苷灌胃10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg，每日1次，共給藥10 d，假手術組與腦出血組分別給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，共給予10 d。

1.4 腦出血大鼠模型建立 所有大鼠術前12 h禁食，6 h禁水，腹腔注射1%氯胺酮(30 mg/kg)進行麻醉，俯臥固定在立體定位儀上，大鼠前囟點與人字點在同一水平面，暴露顱骨，以前囟為原點，往后0.2 mm，左3 mm為穿刺點，牙科鉆垂直鉆穿顱骨，用微量進樣針吸取2.5 μL Ⅶ型膠原酶，從鉆孔點進針，深度約為6 mm，緩緩注入后，留針約5 min，推針，縫合。假手術組除不注射Ⅶ型膠原酶，其他操作同上。

1.5 神經功能缺損評分 建模成功的評分標準參照Longa方法[4]，分為5級：正?；顒?，無神經功能缺損記0分；癱瘓側前肢不能充分伸展計1分；大鼠有向癱瘓側旋轉的行為計2分；向癱瘓側傾倒計3分；無法自發行走，意識喪失計4分；對麻醉清醒后的大鼠進行神經功能評分。1～3分為造模成功，0、4分為造模不成功。

1.6 腦含水量 給藥結束后，戊巴比妥腹腔注射過量麻醉，斷頭，快速取腦，去除嗅球、小腦、腦干和軟腦膜后，迅速稱量濕重，在95～100 ℃烤箱烘烤24 h至恒重，稱量干重，計算腦組織腦含水量。

1.7 MPO活性測定 給藥結束后，過量麻醉，斷頭，快速取腦組織，勻漿，取上清液，嚴格按照MPO試劑盒說明書要求，在25 ℃分光光度計460 nm波長處測定MPO活性，即每分鐘降解1 μmoL時所需要過氧化物的量。

1.8 免疫印跡法檢測相關蛋白表達 末次給藥后，過量麻醉處死大鼠，剪取大鼠血腫周圍腦組織，加入裂解液于冰上裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃離心5 min，收集細胞，提取細胞總蛋白并定量，調整蛋白量。取等量裂解產物，上樣，進行12%SDS-PAGE電泳。轉膜，5%脫脂奶粉室溫放置1 h，將膜于一抗中孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加入對應二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化學發光法顯色，運用Image J圖像分析系統對每個條帶進行灰度分析。

1.9 實時熒光定量PCR 獲得大鼠血腫周圍腦組織后，勻漿，嚴格按照說明書操作，加入1 mL Trizol試劑，室溫放置5 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，提取總RNA，逆轉錄酶催化合成cDNA，以cDNA為模板在聚合酶催化下進行PCR反應，HIF-1α引物：上游5′-CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG-3′，下游5′-TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG-3′；VEGF引物：上游5′- ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG -3′，下游5′- TCACCG CCTCGGCTTGTCACA -3′；GADPH引物：上游5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。94 ℃ 43 s， 61 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共34個循環，實驗結果在熒光定量操作系統中進行分析對比，目標基因的相對定量用2-△△CT計算。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分 造模完成后，僅腦出血組出現2只大鼠死亡，已補充。腦出血組與給藥組大鼠神經功能缺損評分均明顯高于假手術組(P<0.05)；紅景天苷各劑量組神經功能缺損評分低于腦出血組(P<0.05)，但高于假手術組。詳見表1。

表1 各組神經功能缺損評分比較(±s) 分

與Sham組比較，1)P<0.05；與ICH組比較，2)P<0.05

2.2 各組大鼠腦含水量的變化 腦出血組大鼠腦含水量(85.25±0.68)%明顯高于假手術組的(73.82±0.49)%；給予紅景天苷處理后的大鼠腦含水量明顯低于腦出血組大鼠(P<0.05)，藥物低劑量組大鼠為(81.77±0.72)%，藥物中劑量組大鼠為(78.29±0.68)%，藥物高劑量組為(75.97±0.51)%，隨藥物劑量增大腦含水量逐漸下降。

2.3 各組大鼠腦組織中MPO活性變化 腦出血組與給藥組大鼠腦組織中的MPO活性在給藥5 d后達到峰值，隨時間延長而略有下降，紅景天苷處理后的大鼠腦組織中MPO活性顯著低于腦出血組(P<0.05)，并隨藥物劑量增大，而MPO活性降低。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織中MPO活性比較(±s) U/g

與Sham組比較，1)P<0.05；與ICH組比較，2)P<0.05

2.4 腦血腫周圍組織HIF-1α和VEGF的蛋白表達 腦出血組大鼠腦血腫組織的HIF-1α和VEGF的蛋白表達明顯高于假手術組(P<0.05)，采用紅景天苷干預后的HIF-1α和VEGF的蛋白表達顯著高于腦出血組，差異具有統計學意義，并隨藥物劑量增加而表達上調。詳見圖1。

與Sham組相比，*P<0.05；與ICH組相比，#P<0.05

2.5 腦血腫周圍組織HIF-1α和VEGF的mRNA表達 腦出血組大鼠腦腫組織的HIF-1α和VEGF的mRNA表達明顯高于假手術組(P<0.05)，采用紅景天苷干預后的HIF-1α和VEGF的mRNA表達明顯高于腦出血組，差異具有統計學意義。詳見圖2。

與Sham組相比，*P<0.05；與ICH組相比，#P<0.05

3 討 論

本實驗通過注射Ⅶ型膠原酶成功建立腦出血大鼠模型，采用給予不同劑量的紅景天苷，發現大鼠的神經功能缺損評分明顯低于不給藥的大鼠，同時腦含水量下降，推斷紅景天苷對急性腦出血大鼠腦組織具有一定的保護作用。

髓過氧化物酶又稱過氧化物酶，是血紅素輔基的血紅素蛋白酶，具有還原過氧化氫的作用，在成熟的粒細胞中，約占總蛋白質含量的5%，因此MPO活性可以用來測定中性粒細胞的數目。急性腦出血的早期會出現白細胞與中性粒細胞含量的升高，而研究表明白細胞與中性粒細胞計數的增高提示病情嚴重，預后差[5]。本研究結果顯示，急性腦出血大鼠腦組織中MPO的活性顯著上升，并隨時間延長而略有下降，經過紅景天苷處理后，大鼠腦組織中MPO明顯低于腦出血大鼠，提示紅景天苷可能對于腦出血炎癥具有一定程度的抑制作用。

缺氧誘導因子-1α是受乏氧調節的亞基，對缺氧和常氧產生不同的生物效應，在正常狀態下組織幾乎不表達，但在低氧狀態下，HIF-1α的表達增高，并與缺氧程度與缺氧時間相關[6]。HIF-1α的陽性表達率隨腦出血時間延長而增加[7]，另外有調查指出缺氧誘導生成的HIF-1α具有保護腦組織損害的作用[8]。本實驗結果顯示，腦出血大鼠腦組織中HIF-1α的表達明顯增加，而采用紅景天苷處理后，血腫周圍腦組織中HIF-1α的表達顯著高于腦出血組，推測出現腦出血后機體中的HIF-1α會上調，HIF-1α具有保護腦組織免受損害的作用，提示紅景天苷對腦出血后腦組織的損傷具有保護作用。

血管內皮生長因子是HIF-1α的目的基因，能增加微血管與小靜脈血管的通透性。在血管形成之前，VEGF對神經系統具有直接的保護作用，研究表明具有一定的促神經再生作用，在腦缺血灶周腦組織中VEGF的表達顯著上升，微血管密度顯著增加，有效改善缺血半暗帶的血塊[9]。本實驗結果顯示，采用紅景天苷處理后，腦出血大鼠血腫周圍腦組織的VEGF表達明顯高于未處理大鼠，推測紅景天苷通過上調VEGF的表達，改善微血管與小靜脈血管的通透性，促進微血管新生，從而保護腦出血損傷的腦組織。