模擬溶出法研究袋裝口含煙煙堿口腔釋放規(guī)律

王超，楊繼，楊柳，段沅杏，趙楊，趙輝，吳俊，鞏效偉，陳永寬

1 湘潭大學化學學院，湖南 湘潭 411105;

2 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，昆明市北市區(qū)紅錦路367號 650231

無煙氣煙草制品[1]（Smokeless tobacco products，STPs），是一種以非抽吸方式使用的煙草制品，通過口含、吸吮、咀嚼等方式向人體提供尼古丁。產(chǎn)品包括袋裝口含煙、鼻煙和嚼煙等多種多樣的形式。袋裝口含煙是具有一定顆粒度的煙草粉末混合適量的香味物質(zhì)、矯味劑、水、保潤劑和酸堿調(diào)節(jié)劑經(jīng)熱處理加工制成的，用無紡布小袋包裝，置于唇齒之間消費[2]，目前市場上袋裝口含煙產(chǎn)品主要以Snuff（美國）和Snus（瑞典）兩種為主。2017年，袋裝口含煙銷量約7萬噸，主要在美國、瑞典、挪威、阿爾及利亞、突尼斯、加拿大、捷克等國家銷售。其中，美國市場的袋裝口含煙約占全球總銷量的80%，銷售額近120億美元[3]。通過STPs形式進行消費時，煙草不經(jīng)燃燒，不會產(chǎn)生卷煙煙氣，更無“二手煙”，是控煙環(huán)境下煙草消費的重要補充形式。受到當前世界控煙運動的影響，STPs正成為國際煙草領(lǐng)域的重要發(fā)展趨勢。

煙草中生物堿約有50種，其中煙堿約占95%以上[4]。煙堿是STPs的重要成分，主要通過口腔或鼻腔粘膜吸收，作用于人體神經(jīng)系統(tǒng)使吸食者產(chǎn)生滿足感[5]。煙堿釋放量是STPs的重要指標。Rickert等[6]分析了加拿大市場7種類型、30個品牌的STPs中的煙堿含量，結(jié)果表明：從美國進口的Fine cut moist snuff類型口含煙中煙堿平均含量最高，達30.2 mg/g。袋裝口含煙中煙堿的溶出規(guī)律研究及質(zhì)量評價通常通過人群實驗進行，但人群實驗受到倫理、社會等諸多因素的限制，且個體因素影響較大，較難推廣。目前，有不少關(guān)于模擬咀嚼裝置的報道[7-13]。張文娟等[7]開發(fā)一種用于體外評價膠基型STPs煙堿釋放行為的模擬咀嚼機，該裝置利用循環(huán)水箱和載物臺形成的腔，模擬人體口腔，測試時將煙草制品放在里面，利用空氣壓縮機帶動氣動夾子反復(fù)擠壓被測樣品以模擬人體咀嚼狀態(tài)，并結(jié)合高效液相色譜儀檢測煙堿含量。該裝置能較好地模擬膠基型STPs煙堿釋放行為且方法簡便可靠，測試結(jié)果與人體實驗結(jié)果接近。該技術(shù)對STPs質(zhì)量控制、煙堿生物利用度評價以及煙堿調(diào)控具有一定的應(yīng)用價值，但不足之處是不能調(diào)節(jié)咀嚼頻率和咀嚼力度，不能較為真實地反映人們吸食袋裝口含煙的口腔狀況。Luque-Pérez等[10]設(shè)計了一種支撐液膜結(jié)合紫外分光光度計檢測煙堿的釋放量的裝置，該裝置是將煙草制品放在支撐液膜中，然后在受體流中測量釋放的尼古丁。此方法雖然能達到檢測目的，但是受限較多，且穩(wěn)定性差。張杰等[13]開發(fā)了一套能夠模擬STPs煙堿在口腔釋放的體外釋放裝置。該裝置是利用恒溫溶出池來模擬人體口腔，將口含煙放在其中，然后通過恒流泵、恒溫槽、預(yù)熱線圈、保溫管、恒溫溶出池使煙堿在模擬條件下釋放，最后收集不同時間點的釋放液，通過HPLC測定煙堿含量。該裝置操作方便、結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好，能夠較好的模擬口含型STPs在口腔的釋放行為，對口含型STPs的質(zhì)量評價、研發(fā)、生產(chǎn)等具有一定的實用價值，但不足之處是在實驗時不能考察壓力因素對煙堿釋放的影響。上述報道是在固定唾液流速或唾液量下探究不同類型STPs煙堿體外釋放情況，而沒有考察壓力因素和唾液流速對煙堿釋放的影響[1]。為克服以上缺點，本實驗室開發(fā)了一種新型口腔模擬溶出裝置，基于此建立了一種可控性強、穩(wěn)定性好的袋裝口含煙煙堿體外模擬溶出研究方法，并對不同類型袋裝口含煙的煙堿溶出率進行了比較，可為袋裝口含煙產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：調(diào)研收集4種具有代表性的市售袋裝口含煙和1種自制袋裝口含煙。

市售袋裝口含煙： ETTAN（購于瑞典），用于自愿者體內(nèi)釋放實驗，以確定模擬溶出實驗的設(shè)備條件。產(chǎn)品1袋裝口含煙（購于瑞典）；產(chǎn)品2散裝口含煙（購于美國）；產(chǎn)品3內(nèi)裝煙堿復(fù)合鹽型袋裝口含煙（購于瑞典）；產(chǎn)品4為自制袋裝口含煙。5種產(chǎn)品的煙堿含量實測值見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

試劑：煙堿（＞98%，加拿大TRC試劑公司）；甲醇（色譜純，默克股份有限公司）；氯化鎂（AR，上海麥克林生化科技有限公司）；磷酸氫二鈉（AR，天津市風船化學試劑科技有限公司）；碳酸氫鉀（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鈣、一水合檸檬酸（AR，西隴化工股份有限公司）。

儀器：Puff Man 模擬溶出儀（上海帕夫曼自動化儀器有限公司）；Waters ACQUITY超高效色譜儀（美國：Waters公司）；PHS-3C型pH計（上海精密科學儀器有限公司）；Milli-Q50超純水儀（美國Millipore公司）；XP504 型電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；13 mm×0.45 μm水相針式濾器（上海安譜科學儀器有限公司）；HY-8調(diào)速振蕩器（常州國華電器有限公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙堿含量測定

參照Garg[14]的測試方法測定袋裝口含煙中的煙堿。測試時取1粒樣品，準確稱重，用剪刀剪開后放入錐形瓶，加入20 mL磷酸鹽緩沖液和2 mL鹽酸水溶液（0.25 mol/mL），先超聲40min然后再在震蕩器上振蕩30～60 min。取下錐形瓶，靜置，過濾萃取液，最后使用0.45 μm的濾膜過濾，使用反相超高效液相色譜（RP-HPLC）定量分析。色譜條件如下：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇和磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L，pH=6.80），其比例為65：35；流速：0.6 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃；檢測器：UV；檢測波長：259 nm。

1.2.2 口腔模擬溶出基準參數(shù)選擇

選取具有代表性（青年和中年，男性和女性）的7名25～35周歲的健康志愿者（5男2女）進行煙堿體內(nèi)溶出實驗，志愿者基本信息如表2所示，志愿者均來自云南中煙品吸委員會，在吸食產(chǎn)品進行評價的同時，采集其不同時間點唾液和殘留樣品進行測定，對此實驗可能所帶來的風險已告知志愿者并征得其同意。

表2 志愿者基本信息表Tab.2 Basic information of volunteers

在實驗進行前對樣品進行稱重，選取質(zhì)量為（0.86±0.005）g樣品進行實驗。志愿者在進行實驗時應(yīng)遵循以下條件：①實驗開始前30 min內(nèi)不使用與煙草相關(guān)的任何產(chǎn)品；②實驗開始前需用純凈水漱口；③樣品放入唇齒間立刻計時；④實驗過程中不能吃食物、喝水或頻繁講話，唾液吐到相應(yīng)的收集瓶中；⑤實驗進行到一定的時間后殘留樣品放入相應(yīng)的收集瓶中。選取市售口含煙（ETTAN，購于瑞典）分別測定7名志愿者在自然狀態(tài)下口含0～0.5、0～1、0～2、0～5、0～10、0～15和0～20 min之后殘留樣品并收集各個時間段志愿者唾液。采用1.2.1方法測定殘留樣品中的煙堿含量。然后根據(jù)公式（1）計算出志愿者煙堿溶出量，并根據(jù)Grubbs檢驗法剔除異常值。最終以其平均值作為校正口腔模擬溶出參數(shù)的依據(jù)。

其中，M1-煙堿溶出量，μg；

M0-樣品實測煙堿含量均值，μg；

M2-殘留樣品中煙堿含量，μg。

1.2.3 體外模擬溶出實驗

實驗前將配制好的人工唾液加入儲液瓶中，置于恒溫水浴鍋內(nèi)恒溫至37℃。開機設(shè)定模擬口腔溫度為37℃，設(shè)定模擬溶出裝置參數(shù)，將待測試的口含煙放入模擬口腔內(nèi)，在電機的帶動下人工齒下降壓住口含煙模擬人體吸食，到達預(yù)先設(shè)置的條件后，立即取出殘留樣品。每個時間點使用一?？诤瑹?，分別收集0～0.5、0～1、0～2、0～5、0～10、0～15和0～20 min時殘留樣品，采用1.2.2所示公式和1.2.1所示方法測定其煙堿含量。每次實驗完成后，模擬口腔相關(guān)組件需用人工唾液清洗干凈方可進行下一組實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 模擬溶出溫度的確定

人體口腔溫度一般在37℃左右[15]，實驗時選37℃來模擬口腔溫度，人工唾液通過恒溫加熱器加熱至37℃。

2.1.1 人工唾液配方和各時間段用量的確定

唾液由口腔腮腺、下頜下腺等分泌的混合產(chǎn)物，其成分比較復(fù)雜。主要包括水分、無機鹽和各種蛋白，其中水分含量最高，約占其99%，在未接受刺激的條件下pH為6.71～6.90[16-17]。目前人工唾液主要分為純無機鹽溶液和帶有蛋白酶等具有生物活性的無機鹽溶液兩大類[18]。且有研究表明是否帶有蛋白酶等具有生物活性的人工唾液對煙堿的釋放影響不大[12]。本實驗的體外溶出介質(zhì)選用Morjaria等[19]介紹的一種歐洲藥典收錄的模擬咀嚼裝置時使用的人工唾液，配方如表3所示。

表3 人工唾液配方Tab.3 The formula of artificial saliva

使用口含煙時的唾液分泌量因年齡、刺激強度、實驗采集方法和人種等因素而不同。Dawes等[20]收集了24名年輕人在不同場合咀嚼6種口香糖時分泌的唾液量數(shù)據(jù)，表明在咀嚼口香糖口腔受到刺激時，唾液分泌速度在第1 min達到峰值，隨后隨著刺激的降低唾液分泌速度下降。Polland等[21]研究了90 min內(nèi)持續(xù)咀嚼薄荷風味口香糖的結(jié)果表明：體內(nèi)唾液流速在2 min時出現(xiàn)峰值（2.57±0.7 mL/min），唾液的平均流速范圍從0.88 mL/min（20 min內(nèi)）到0.55 mL/min。參考上述結(jié)果，并通過本實驗收集到的志愿者數(shù)據(jù)，確定各時間段人工唾液加入量如表4所示。

使用口含煙時的唾液分泌量因年齡、刺激強度、實驗采集方法和人種等因素而不同。Dawes等[20]收集了24名年輕人在不同場合咀嚼6種口香糖時分泌的唾液量數(shù)據(jù)，表明在咀嚼口香糖口腔受到刺激時，唾液分泌速度在第1 min達到峰值，隨后隨著刺激的降低唾液分泌速度下降。Polland等[21]研究了90 min內(nèi)持續(xù)咀嚼薄荷風味口香糖的結(jié)果表明：體內(nèi)唾液流速在2 min時出現(xiàn)峰值（2.57±0.7 mL/min），唾液的平均流速范圍從0.88 mL/min（20 min內(nèi)）到0.55 mL/min。參考上述結(jié)果，并通過本實驗收集到的志愿者數(shù)據(jù)，確定各時間段人工唾液加入量如表4所示。

表4 唾液量對比表Tab.4 comparison of saliva amount

2.1.2 模擬溶出壓合力的確定

口含煙在消費時受到一定的壓力。艾明歡等[22]設(shè)計了透皮擴散池與豬口腔黏膜配套裝置，結(jié)合高效液相色譜（HPLC）法，研究了口含型無煙氣煙草制品煙堿在口腔黏膜中不同條件下的滲透行為，結(jié)果表明：壓力明顯影響煙堿的滲透速率。本裝置通過更換不同重量的砝碼達到不同的壓合力。以志愿者吸食的ETTAN口含煙中煙堿的體內(nèi)溶出量M1值為校正目標，先確定壓合力度不變，改變模擬溶出唾液加入量對煙堿含量進行體內(nèi)、體外實驗對比，以確定唾液量；15～20分鐘后，由于煙堿溶出已較多，消費者習慣性會增加壓合力度，以獲得持續(xù)的生理滿足感，且實驗中在確定了唾液量的基礎(chǔ)上，調(diào)整了不同的壓合力以使體內(nèi)外煙堿溶出量盡量一致，實驗參數(shù)調(diào)整如表5所示。

表5 體內(nèi)外煙堿溶出量參數(shù)調(diào)整表Tab.5 Parameter adjustment of nicotine dissolution in vitro and in vivo

最終確定的體外模擬溶出參數(shù)如表6所示，煙堿的體內(nèi)和體外溶出趨勢圖如圖1所示。由圖1可以看出，煙堿的體內(nèi)體外溶出曲線趨勢基本一致，說明該方法能很好地模仿袋裝口含煙中煙堿的體內(nèi)溶出規(guī)律。

表6 袋裝口含煙煙堿模擬溶出參數(shù)Tab.6 Simulated dissolution parameters of nicotine in pouched smokeless tobacco product

圖1 口含型無煙氣煙草制品中煙堿的體內(nèi)和體外溶出趨勢Fig.1 In vivo and in vitro release trend of nicotine in oral smokeless tobacco product

2.2 模擬溶出裝置參數(shù)的穩(wěn)定性實驗

以志愿者吸食的ETTAN為樣品，使用模擬溶出裝置按照上述模擬溶出參數(shù)進行穩(wěn)定性測試，重復(fù)4次以相對標準偏差（RSD）來判斷模擬溶出裝置及參數(shù)的穩(wěn)定性。由表7可知，實驗樣品的RSD范圍為2.11%～5.03%，表明方法的結(jié)果較可靠，對該類產(chǎn)品的體外溶出研究有一定參考價值。

表7 模擬咀嚼溶出參數(shù)穩(wěn)定性Tab.7 Parameter stability of buccal cavity simulator

2.3 典型實驗樣品的模擬溶出實驗

利用上述方法測試市場上代表性袋裝口含煙產(chǎn)品和自主開發(fā)產(chǎn)品，結(jié)果如表8和圖2。由表8和圖2可以看出4種典型口含煙的煙堿溶出呈現(xiàn)先快后慢的趨勢，產(chǎn)品1和產(chǎn)品4煙堿溶出顯著低于另外兩款產(chǎn)品。在20 min時所有產(chǎn)品煙堿溶出量都能達到60%，產(chǎn)品3煙堿溶出量最高為80%。

對比四種產(chǎn)品可知，不同類型口含煙煙堿溶出率也不盡相同。自制袋裝口含煙和國外進口袋裝口含煙有相似的溶出規(guī)律，和產(chǎn)品二（散裝口含煙）對比可以發(fā)現(xiàn)無紡布對煙堿溶出有一定的阻礙作用，煙堿復(fù)合鹽型袋裝口含煙具有最高的煙堿溶出率。

表8 典型實驗樣品模擬溶出數(shù)據(jù)表Tab.8 Simulated dissolution data of typical experimental samples

圖2 典型實驗樣品中煙堿體外溶出率Fig.2 In vitro dissolution rate of nicotine in typical experimental samples

3 結(jié)論

利用新型模擬口腔裝置以人工齒模擬人口腔牙齒，以人工舌模擬人口腔舌頭，以裝置口腔模擬人口腔，經(jīng)過對溫度、唾液流速、唾液加入量和口腔壓力的調(diào)節(jié)建立了一種可控、可靠的煙堿體外模擬溶出研究方法，該方法能比較真實的模擬口含煙在口腔中的消費條件，且能很好地模仿口袋裝口含煙中煙堿的體內(nèi)溶出規(guī)律，具有操作簡單，穩(wěn)定性好的特點。采用建立的方法測定了主流的口含煙樣品，試驗數(shù)據(jù)符合產(chǎn)品類型特點，進一步證明了方法的可行性。因此，該模擬溶出法能為袋裝口含煙的加工制作及質(zhì)量評價等提供良好的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。