生防菌株LB-1對煙草白粉病的抑制效果及對病菌孢子萌發的影響

劉彩云，許瑞瑞，劉春香

濰坊學院生物與農業工程學院“十三五”山東省高等學校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊 261061

煙草白粉病是由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）[1-2]或奧隆特高氏白粉菌（Golovinomyces orontii）[3]侵染引起的病害。兩種白粉病菌都可通過分生孢子產生初生芽管、附著胞，并以吸器從寄主細胞獲取營養物質從而導致煙草葉片枯黃、整株枯死、調制后缺乏彈性和香氣[2-4]。目前我國煙草白粉病防治以化學防治為主，生防菌研究較少。已報道的對煙草白粉病具有生防效果的微生物有云芝菌（Coriolus versicolor）[5]、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）[6]、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）[7]、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）[8]等。

毛殼菌（Chaetomium spp.）是一類極具生防潛力的真菌類群[9]，被報道具有生防作用的有球毛殼（C.globosum）[10-12]、螺旋毛殼（C.spirale）[13]、角毛殼（C.cupreum）[14]等，但毛殼菌應用于煙草白粉病防治的研究鮮有報道。本研究前期篩選獲得一株近緣毛殼菌株LB-1，該菌株對多種植物病原真菌都具有很好的拮抗作用[15]。本文以白粉病感病煙草品種中煙90[4]為供試材料，研究了LB-1對煙草白粉病的抑制效果及對病菌分生孢子萌發的影響，為煙草白粉病的生物防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

中煙90種子由中國農業科學院煙草研究所提供。采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基（20%土豆煎汁、2%葡萄糖、2%瓊脂粉）培養生防菌株LB-1，采用馬鈴薯葡萄糖液態（potato dextrose broth，PDB）培養基（20%土豆煎汁、2%葡萄糖）振蕩培養獲得LB-1發酵液，采用瓊脂保鮮培養基（0.6%苯并咪唑，2%瓊脂粉）培養煙草離體葉段。

1.2 方法

1.2.1 盆栽煙苗的培育、接種

中煙90種子催芽后播種于育苗盤中，隔離培育（17～25℃，自然光照）至成苗期后移栽到小花盆中。煙苗隔離培養7 d后采用孢子沉降法接種煙草白粉病菌，即放置盆栽苗于接種筒底部，將預先繁殖的新鮮煙草白粉病菌通過黑色紙卷從接種筒上部吹入，使病菌孢子散落在接種筒底部的盆栽苗上。

1.2.2 菌株LB-1菌懸液和發酵液的制備

刮取PDA平板上預先培養的LB-1菌絲體，用無菌生理鹽水稀釋為1×105cfu/mL的菌懸液；以體積比1:10的比例接于PDB培養液中，25℃、120 r/min振蕩培養15 d，培養液經雙層紗布過濾，4℃、12000 r/min條件下離心15 min，上清液即為LB-1發酵液。

1.2.3 菌株LB-1對煙草白粉病的抑制作用

盆栽苗測定：煙草盆栽苗在接種白粉病菌前和接種后24 h分別葉面噴施LB-1發酵液和菌懸液各1次（每株煙苗噴施20 mL），繼續隔離培養（17～25℃，自然光照）至對照植株葉片充分發病后，參照國標煙草病蟲害分級及調查方法[16]分析并計算病情指數和防效。每一處理設15盆煙苗（每盆1株）。調查時每個植株從頂部第3個葉片開始，向下取3個葉片。對照植株接種前和接種后24 h分別用無菌蒸餾水噴施一次（每株煙苗噴施20 mL）。

離體葉段測定：剪取健康煙草植株主脈兩側的葉片組織，在菌株LB-1發酵液和菌懸液中分別浸蘸后，正面朝上放置在瓊脂保鮮培養基平板上，孢子沉降法接種后培養8 d（22℃，12 h光照），調查離體葉段上的病斑數，計算抑制率[17]。每個處理設9皿，每皿2個葉段。為使LB-1菌懸液和發酵液在煙草葉片上更好的附著，LB-1發酵液和菌懸液中分別加入了0.03%的吐溫20[18]，并在實驗中設置0.03%吐溫20處理，對照為無菌蒸餾水處理。

1.2.4 菌株LB-1發酵液對白粉病菌孢子萌發的抑制作用

采用孢子沉降法接種煙草白粉病菌于薄層PDA平板，每皿噴施LB-1發酵液1 mL，22℃、自然光照下培養。2 h、18 h后培養皿直接置于相差顯微鏡下觀察白粉病菌孢子萌發情況，統計孢子萌發率，并觀察孢子和芽管的形態。處理和對照各設5個培養皿的重復，統計孢子萌發率時每個培養皿隨機取3個視野，每視野萌發孢子占總觀察孢子的比例為萌發率。孢子初生芽管長度超過孢子體一半即視為萌發。對照為無菌水處理。

1.3 數據分析

采用SAS 8.1對試驗數據進行統計分析，采用最小顯著差異法（LSD）檢驗各實驗數據之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 菌株LB-1對煙草白粉病的抑制作用

菌株LB-1對煙草盆栽苗和離體葉段白粉病的抑制作用檢測結果如表1、表2所示。LB-1菌懸液葉面處理對煙草白粉病發生無明顯影響，但LB-1發酵液能顯著降低中煙90葉片白粉病的發生程度，煙草盆栽苗和離體葉段上的防效和抑制率分別為44.90%和53.11%。0.03%吐溫20作用效果甚微。

表1 LB-1菌懸液和發酵液對煙草盆栽苗白粉病發生的影響Tab.1 Effects of LB-1 suspension and culture broth on tobacco powdery mildew in pot seedlings

表2 LB-1菌懸液和發酵液對煙草離體葉段白粉病發生的影響Tab.2 Effects of LB-1 suspension and culture broth on tobacco powdery mildew in detached-leaf segments

2.2 菌株LB-1發酵液對煙草白粉病菌孢子萌發的抑制

接種在薄層PDA平板上的煙草白粉病菌孢子經LB-1發酵液噴施處理后，對孢子萌發影響不明顯，發酵液和對照處理的孢子萌發率分別為81.79%和89.70%，但發酵液處理的孢子體出現了皺縮畸形（圖1A），而對照無菌水處理的孢子則表現正常（圖1B）；18 h時，LB-1發酵液處理的孢子雖然萌發產生了芽管，但是芽管短，有的出現了分叉，孢子體皺縮畸形（圖1C），而對照無菌水處理的孢子則發育正常，形成了附著孢（圖1D）。

圖1 菌株LB-1發酵液處理的煙草白粉病菌孢子萌發特點Fig.1 Characteristics of conidia germination of E.cichoracearum DC treated by LB-1 culture broth

3 討論

蔡琳等[8]研究發現，枯草芽孢桿菌第2次和第3次葉面處理后對煙草白粉病田間防效分別為44.93%和71.58%；而王靜等[6]研究發現，短小芽孢桿菌AR03不同濃度菌懸液處理對煙草白粉病的防治效果也存在顯著差異。本研究中近緣毛殼菌株LB-1發酵液在接種白粉病菌前后葉面處理煙草盆栽苗2次，可獲得44.90%的防效，與蔡琳等[8]測定的枯草芽孢桿菌作用效果相當。

LB-1發酵液能夠引起煙草白粉病菌孢子皺縮，芽管發育畸形，這表明發酵液中含有影響病菌孢子生長發育的活性物質，但活性物質及其作用機理還有待于明確。LB-1菌懸液對煙草白粉病菌無明顯生防效果，這表明LB-1菌體與煙草白粉病菌無直接互作，但LB-1是否能夠通過定殖煙草葉片發揮生防作用還有待于進一步檢測。