烤煙煙葉類黃酮合成關鍵酶活性及其調控基因的表達分析

高婭北，李成剛，陳二龍，張明剛，孔德輝，孫占偉，史龍飛，宋朝鵬

1 河南農業大學煙草學院，鄭州文化路95號 450002；

2 河南中煙工業有限責任公司，河南 鄭州 450016；

3 河南中煙工業公司安陽卷煙廠，河南 安陽 455000；

4 河南省煙草公司洛陽市公司，河南 洛陽 471000

類黃酮是植物體內的一種重要次生代謝物質，其本身所具有的抗氧化特性對植物的品質形成有重要意義[1-2]。在煙草中，類黃酮含量的高低直接影響烤后煙葉的等級、香氣質量等煙葉品質因素[3]。成熟期是煙葉品質形成的關鍵時期，也是煙葉類黃酮合成積累的關鍵時期，因此，研究成熟期烤煙類黃酮合成機理具有重要意義。大量研究表明PAL、C4H、4CL、CHS和CHI是植物黃酮類物質代謝途徑中的合成相關酶[4-6]，在許多作物的研究中證實這些酶活性和基因表達量的高低可直接影響類黃酮的積累量[7-9]。對于烤煙而言，較低的生長溫度可增強煙葉PAL、C4H、4CL和CHI酶活性，從而增加煙葉類黃酮的積累量[10]；張剛[11]研究表明，施氮水平過高會影響煙葉PAL、C4H、4CL和CHI酶活性，減少煙葉類黃酮的積累量；賈宏昉等[12]研究表明不同生態區烤煙煙葉類黃酮積累量受PAL、C4H、4CL、CHS和CHI等基因表達量調控；Jia等[13]研究表明，無機磷的缺乏可導致煙葉類黃酮合成的相關基因CHS和CHI等轉錄水平的增加，促進煙葉類黃酮的積累。目前對于煙葉類黃酮合成的研究多集中于相關酶活性變化或是合成相關酶基因的表達量差異等單一方面，缺乏對烤煙成熟期類黃酮合成量、相關酶活性變化及基因表達模式的系統性研究，烤煙成熟期類黃酮合成機理尚不明確。本研究以烤煙品種豫煙6號、K326和ND202為材料，測定煙株打頂后不同時期中部葉類黃酮含量及上游合成相關酶PAL、C4H、4CL、CHS和CHI的活性變化，分析煙葉成熟過程中類黃酮合成路徑上游相關酶基因的表達規律，旨在系統探究成熟期煙葉類黃酮的合成規律，為烤煙品種選育及優質煙葉生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

田間試驗于2017年在河南省洛陽市洛寧縣煙草科技示范基地（地處東經111°38＇，北緯34°26＇）進行。試驗田植煙土壤為黃棕壤，肥力中等，0～20cm土層含有機質13.52 g/kg、堿解氮75.18mg/kg、速效磷9.17 mg/kg和速效鉀164.37 mg/kg，土壤pH7.26。

選用豫煙6號、K326和ND202為試驗品種，重復3次，共9個小區，采用隨機區組設計，每小區種植煙株300株，行距110 cm，株距55 cm，按照當地優質煙葉生產技術規范種植管理，煙田施氮量為72kg/hm2，使用煙草專用復合肥，N∶P2O5∶K2O＝1∶1∶2。打頂后當d、10d、20d、30d、40d和50d取樣（打頂后30d中部葉達到適熟狀態），每小區采集生長情況正常、葉片完整且朝向一致的烤煙中部葉（10～12葉位）10片，采后在30分鐘內去除主脈，混合第6至第7支脈間葉肉樣品10g左右，用錫紙和紗布包裹后放入液氮中速凍，置-80℃超低溫冰箱保存，用于煙葉類黃酮含量、類黃酮合成相關酶活性以及合成相關酶基因表達量的測定。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 類黃酮含量測定方法

取-80℃保存的煙葉樣品采用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥，將干燥后的樣品磨碎過40目篩。稱取樣品0.1g采用植物類黃酮試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司生產）進行煙葉類黃酮含量的測定。

1.2.2 類黃酮合成關鍵酶活性的測定

粗酶液提取：稱取0.1g-80℃保存的煙葉樣品，加入1mlPBS緩沖液冰浴勻漿，10000g 4℃離心10min，置于冰上待測。PAL、C4H、4CL和CHI酶活性采用微量法酶活性試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司生產）測定；CHS酶活性采用植物查爾酮合成酶ELISA試劑盒（上海通蔚實業有限公司生產）測定。

1.2.3 類黃酮合成關鍵酶基因表達量分析

采用Trizol法提取煙草樣品中總RNA，反轉錄合成cDNA[14]。通過NCBI搜索植物類黃酮相關基因的cDNA序列，設計qRT-PCR引物（表1），利用QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，Germany）在LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀（Roche，Swiss）上進行qRT-PCR檢測。選用煙草核糖體蛋白編碼基因NtL25作為內參基因。實驗結果采用2-ΔΔCt[15]算法進行分析，確定各基因的相對表達量。試驗設置3次重復。植物類黃酮生物合成路徑見圖1。

1.3 數據分析

運用Microsoft Excel 2010進行試驗結果統計整理，運用Origin 2018進行圖片繪制，運用SPSS 22進行數據分析。

表1 煙草類黃酮合成相關酶基因qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence for tobacco flavonoid synthetase gene

圖1 植物類黃酮生物合成路徑Fig.1 Plant flavonoid biosynthesis pathway

2 結果

2.1 煙葉類黃酮含量變化

三個烤煙品種的類黃酮含量測定結果（表2，3）表明，不同品種及不同時期間烤煙煙葉類黃酮含量均有極顯著差異；三個烤煙品種煙葉在打頂后即煙株進入成熟期，類黃酮含量呈現出先增加后降低的變化趨勢，在成熟時（打頂后30d）含量達到最大值，而后隨成熟度進一步增加含量逐漸降低，表明成熟期是煙葉類黃酮積累的重要時期。品種間比較發現，類黃酮含量基本表現為豫煙6號＞K326＞ND202，其中ND202煙葉類黃酮含量除打頂后20d外均顯著低于其他兩品種，豫煙6號煙葉類黃酮含量在打頂后當天、30d和40d均顯著高于其他兩品種。

表2 烤煙煙葉類黃酮含量方差分析Table 2 Variance analysis of flavonoids content in flue-cured tobacco leaves

2.2 類黃酮合成相關酶活性的變化

類黃酮合成相關酶PAL、C4H、4CL、CHS和CHI活性測定結果（圖2）表明，這些相關酶與類黃酮含量的變化趨勢相同，類黃酮合成相關酶活性基本呈現出先升高后降低的變化規律。三個品種間類黃酮合成相關酶活性除個別時期外，基本表現為豫煙6號＞K326＞ND202，說明不同基因型烤煙品種間類黃酮合成水平差異較大。C4H、4CL、CHS和CHI酶活性基本都在煙葉成熟時（打頂后30d）達到最大值，而后活性迅速降低，說明成熟期是煙葉酶促反應發生的關鍵時期。

各品種煙葉PAL活性均在打頂后20d達到最大 值，分 別 為70.69、77.76和83.20U·mg-1·FW，隨后活性迅速降低，于打頂后50d降至最低值（圖2-A）。各品種煙葉C4H和4CL活性變化趨勢較為一致，均在打頂后表現出先略有下降，而后上升的趨勢（圖2-B、圖2-C），各品種煙葉C4H活性均在打頂后30d最高，隨后迅速降低，于打頂后50d降至最小值，活性降低50%左右，豫煙6號和K326煙葉4CL活性在打頂后30d活性達到最大值，而K326在打頂后40d活性達到最大值，豫煙6號和K326煙葉4CL活性無明顯差異。各品種煙葉CHS和CHI活性均表現出先緩慢增加，于打頂后30d達最大值，而后降低的變化趨勢（圖2-D、圖2-E），各品種間活性差異較小。

2.3 類黃酮合成相關酶基因的qRT-PCR表達量

煙草類黃酮合成酶基因相對表達量測定結果（圖3）表明，打頂后不同品種煙葉各時期類黃酮合成相關酶基因相對表達量基本表現為豫煙6號＞K326＞ND202，說明不同基因型間基因表達差異也較大。PAL基因表達量在打頂后逐漸上調，在打頂后30d表達量相對較高，而后迅速下調；C4H基因表達量在打頂后逐漸上調，在打頂后30d達到最大值，而后略有下調趨勢，但各時期變化浮動較小；4CL1基因表達量在打頂后波動性較大，變化規律不明顯，且各時期表達量變化差異較小；4CL2基因表達量在打頂后表現出緩慢上調趨勢，于打頂后30d達到峰值，前后變化差異較大；CHS、CHI基因表達量均在打頂后30d達到最大值，其中CHI基因表達量在打頂后變化不明顯，而CHS基因在打頂后表達量表現出迅速上調的趨勢。因此，PAL、4CL1和CHS基因表達量與類黃酮積累變化趨勢相同，在煙葉類黃酮的合成積累過程中貢獻較大。

表3 不同品種烤煙成熟期煙葉類黃酮含量變化Table 3 Change of flavonoid content in leaves of different flue-cured tobacco species during maturity stage OD·g-1·FW

圖2 不同烤煙品種成熟期煙葉類黃酮合成相關酶活性Fig.2 Flavonoid synthetase activities in mature leaves of different flue-cured tobacco species

2.4 類黃酮含量與酶活、基因表達量的相關性分析

圖3 不同烤煙品種成熟期煙葉類黃酮合成相關酶基因表達量Fig.3 Gene expression of flavonoid synthetase in mature leaves y of different flue-cured tobacco varieties

由表4可見，除4CL1基因外，煙葉類黃酮含量與合成相關酶活性、基因表達量均呈正相關關系。PAL、CHS和CHI活性與類黃酮含量相關性較強，其中PAL和CHI活性與類黃酮含量呈顯著正相關關系（p＜0.05，r=0.8,0.81），CHS活性與類黃酮含量呈極顯著正相關關系（p＜0.01，r=0.88），說明PAL、CHS和CHI活性的提高可能對類黃酮含量的積累有促進作用，其中CHS的促進作用更強；類黃酮合成相關酶基因中除4CL1外，其他基因表達量與類黃酮含量相關性均較強，其中PAL、C4H、4CL2和CHI基因表達量與類黃酮含量呈顯著正相關關系（p＜0.05，r=0.82,0.78,0.79,0.82），CHS基因表達量與類黃酮含量呈極顯著正相關關系（p＜0.01，r=0.96），說明PAL、C4H、4CL2和CHS基因可能對類黃酮含量的積累有調控作用，其中CHS的調控作用更強。各類黃酮合成關鍵酶活性間呈正相關關系，其中PAL酶活性與其他合成相關酶活性間相關性較弱，而其他酶活性間相關性較強，分別達到了顯著或是極顯著相關關系，說明這些合成酶間具有明顯的協同作用；類黃酮合成相關酶活性與基因表達量間，除4CL1基因外均呈正相關關系，其中4CL1、4CL2和CHI基因表達量與各合成相關酶活性間相關性較弱，其他基因表達量與類黃酮合成相關酶活性相關性較強，除個別酶外，二者相關性達到顯著或是極顯著正相關關系。

表4 類黃酮含量與酶活、基因表達量的相關性分析Table 4 Correlation analysis between flavonoid content and enzyme activity and gene expression

3 討論

烤煙類黃酮是煙葉組織中的一種重要的抗氧化物質，可在一定程度上減輕或消除逆境脅迫所引起的活性氧傷害，提高煙株的抗逆性[16]，同時也是煙葉中的一種重要的潛香型物質可被氧化酶直接催化生成醇類及呋喃類等香味物質，影響煙葉香氣質量[17]，其含量與煙葉品質密切相關。烤煙類黃酮含量受栽培措施、環境因子及遺傳因素等的共同影響[18-20]。鐘楚等[21]研究表明，在不同的UV-B輻射處理下，烤煙煙葉類黃酮含量隨煙葉的成熟而逐漸增加；董卓婭[22]研究表明，在不同緯度下，打頂后烤煙煙葉類黃酮含量隨成熟度增加而增長，工藝熟期達到最大；本研究結果表明不同品種烤煙打頂后成熟期煙葉類黃酮含量均表現出相似的變化規律，煙株從打頂后至打頂后50d的成熟過程中，煙葉類黃酮含量呈現出先升高后降低的變化規律，于成熟時（打頂后30d）達到最大值。不同品種間煙葉類黃酮含量在成熟期各階段差異顯著，這可能與其品種遺傳特性有關。

植物類黃酮代謝與其相關酶活性密切相連，首先由苯丙氨酸代謝途徑中的PAL、C4H和4CL三個酶進行連續催化，形成類黃酮化合物的底物香豆酰輔酶A，而后在CHS的催化下形成查爾酮類化合物，CHS將苯丙氨酸途徑次生代謝產物導向類黃酮化合物的生物合成，是類黃酮化合物代謝途徑中的首個關鍵酶，隨后由CHI進行進一步催化進行類黃酮單體的生成[23]。彭東、王愛華等[24-25]研究表明煙葉PAL、C4H和4CL活性隨煙葉成熟而增強，成熟后隨煙葉衰老而降低，本研究表明，烤煙煙葉PAL活性在打頂后呈現先升高后降低的變化規律，于接近成熟時達到最大值，這與前人的研究結果相似；C4H和4CL活性在打頂后先降低，這可能是由于打頂所引起煙株體內生理生化反應出現變化所引起的；各品種煙葉類黃酮合成相關酶活性均在打頂后逐漸升高，于成熟時達到最大值，這說明成熟期是烤煙類黃酮代謝的關鍵時期；成熟后各品種煙葉類黃酮合成相關酶活性均呈快速降低的變化趨勢，可能是由于隨生育期的延長煙葉逐漸衰老，體內生理代謝活動減弱所引起的。

PAL、C4H、4CL、CHS和CHI是烤煙類黃酮合成的相關酶，大量研究表明其基因參與了煙葉的類黃酮合成調控。本研究表明，不同品種烤煙成熟期PAL基因表達量呈先升高后降低的變化趨勢，這與連文力[26]所研究的烤煙生育期PAL、CHS和CHI基因表達量變化規律相似；C4H基因表達量也呈現先升高后降低的變化趨勢，這與楊慧芹[27]的研究結果不同，可能是由于煙株在生長發育期間的生長溫度不同所引起的；4CL1基因表達量在成熟期變化規律不明顯，前后波動較大，與4CL2表達量變化趨勢差別較大，這表明4CL2基因對類黃酮合成的調控作用較大，4CL1基因對類黃酮合成的調控作用不大；各品種煙葉基因表達量基本表現出成熟期迅速上調，過熟衰老后迅速下調的趨勢，說明成熟期是煙葉類黃酮合成關鍵基因對類黃酮合成調控的關鍵時期；各品種之間基因表達量的差異可能與其品種生態適應性及遺傳特性有關。

本研究中相關分析表明， PAL和CHI活性與煙葉類黃酮含量達顯著正相關水平，而CHS活性達極顯著正相關水平，表明PAL、CHS和CHI活性對煙葉類黃酮含量的積累影響較大；PAL、C4H、4CL2和CHI基因表達量與煙葉類黃酮含量達顯著正相關水平，而CHS基因達極顯著正相關水平，表明PAL、C4H、4CL2、CHS和CHI基因對煙葉類黃酮合成的調控作用較強；因此可根據PAL、CHS、CHI活性和PAL、C4H、4CL2、CHS和CHI基因表達高低來判斷煙葉類黃酮的合成積累水平；在本研究中，4CL1基因對煙葉類黃酮的合成呈負相關且相關系數較小，與4CL2基因差異較大，這主要是由于二者在苯丙氨酸代謝途徑中分別負責調控不同代謝產物的生物合成所引起的[28]。

4 結論

在烤煙中部葉成熟期，葉片類黃酮含量呈現先增加后降低的變化規律，打頂后0-30d是煙葉類黃酮合成積累的關鍵時期，在葉片成熟時期含量達到最大值；在同一生態環境及栽培管理條件下，成熟期各階段均以豫煙6號中部葉類黃酮含量最高；測定類黃酮合成酶活性發現，PAL、CHS和CHI三個類黃酮合成酶活性對煙葉類黃酮合成的相關性較大，其中CHS合成酶最大（p＜0.01，r=0.88）；基因表達模式研究發現，PAL、C4H、4CL2、CHS和CHI基因對煙葉類黃酮含量的積累相關性較大，其中CHS基因最大（p＜0.01，r=0.96），是煙葉類黃酮合成過程中的關鍵調控基因。本研究從分子生物學角度探究了不同品種烤煙中部葉成熟期葉片類黃酮合成、關鍵合成酶活性及其基因表達的規律，為烤煙品質形成的分子作用機理提供了理論基礎。