雷公藤多苷對Pristane誘發性紅斑狼瘡外周血T細胞漂移及細胞因子的影響

周 嬌，張小喬，戴紅偉

0 引言

系統性紅斑狼瘡是一類細胞免疫和體液免疫異常的全身多系統受累的自身免疫性疾病，自身免疫調節功能紊亂是其主要病因，表現為自身反應性T細胞大量增生和B細胞功能亢進，細胞因子表達異常、自身抗體產生和免疫復合物清除障礙而引起機體多個器官損傷[1]。有研究發現，系統性紅斑狼瘡患者Th及Tc細胞亞群失衡，這種自身免疫調節功能紊亂與Tc1、Tc2細胞漂移有關[2-3]。在對正常健康人群流行病學調查中發現，Tc1和Th1細胞百分比、Th1/Th2比值和Tc1/Tc2比值均顯著低于系統性紅斑狼瘡活動期患者，這進一步證實T細胞漂移及細胞因子改變是系統性紅斑狼瘡發病的重要機制[4-5]。鑒于此，研究藥物對T細胞漂移及細胞因子的影響有助于該病的治療。本實驗通過Pristane腹腔注射誘導BALB/c裸鼠系統性紅斑狼瘡動物模型，再用雷公藤多苷灌服的方法觀察其對該模型鼠外周血T細胞漂移及細胞因子的影響，分析雷公藤多苷調控與系統性紅斑狼瘡發病機制密切相關的T細胞漂移過程，為臨床治療系統性紅斑狼瘡提供理論和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 雌性清潔級BALB/c裸鼠24只，體重(26.5±1.0)g，購自廣東省醫學實驗動物中心，質量合格證：SCXK(鄂)2018-001，在隨州醫院動物中心標準實驗室完成實驗，設施合格證編號：SYXK(鄂)2018-001。遵循3R原則，保證動物福利，造模前1周放空氣層流柜中無菌飼養，飼料和飲用水滅菌處理，飼料中加入紅霉素。動物用隨機數字表法隨機均分為模型組、0.25 mg/(kg·d)組、0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組，每組6只。

1.2 儀器及試劑 雷公藤多苷片(廣東華南藥業集團有限公司，Z44023753)；Pristane注射液(Sigma,批號:RNBB4308V)；RPMI 1640培養液購于Gibco公司(美國)；淋巴細胞分離液購于上海試劑廠；流式細胞儀購于PaTec公司(德國)；CIMFITC、CD3TRI-COLOR、CD4TRI-COLOR和CD8R-PE均購于Cahag公司(美國)；CD4+-FITC、CD8+-PE-CY-5購于Bection Dickinson公司(美國)。

1.3 造模和干預 Pristane誘發Balb/c裸鼠系統性紅斑狼瘡造模方法參照文獻[6]，將裸鼠24只單次腹腔注射0.5 ml Pristane，3個月后可建立穩定的系統性紅斑狼瘡動物模型。實驗動物干預性用藥根據人與實驗動物用藥換算公式計算，治療組雷公藤多苷用藥量分別為0.25、0.5、1 mg/(kg·d)。模型組按1 ml/鼠灌服0.9%生理鹽水對照。

1.4 流式細胞術檢測Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴細胞亞群分類及細胞因子 分別于治療前、治療3個月和6個月從尾靜脈采血，采用直接熒光標記的流式細胞術檢查治療不同階段Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴細胞亞群分類。檢測時先將外周血制備成PBMNC懸液，然后取75 μl加入300 μl的無小牛血清的RPMI 1640液中，再分別加入Ionomycin液10 μl，BFA液14 μl，PMA液46 μl混勻，置于通有5%CO2、37 ℃的培養箱中培養5 h。取標記為A1、A2、A3、A4的流式細胞儀試管4只，各加入100 μl孵育好的上述培養液。A1、A2、A3、A4流式細胞儀試管中加入Reagan A固定液50 μl，混勻后避光、室溫下二次孵育。孵育20 min后，每支試管中加入PBS 2 ml，混勻后離心(離心力：1 000×g，5 min)，棄上清，分別加入Reagan B 50 μl混勻，避光、室溫下孵育。孵育20 min后向管中加入PBS 2 ml，混勻后離心(離心力：1 000×g，5 min)，棄上清。每管中分別加入相應抗體10 μl(A1:Anti-IFN-γ-PE,A2:Anti-IL-2-PE,A3:Anti-IL-4-PE,A4:Anti-IL-10-PE)，混勻后避光、室溫下孵育。孵育20 min后，再次向A1、A2、A3、A4管中加入PBS 2 ml，混勻后離心(離心力：1 000×g，5 min)，棄上清，加1 ml PBS重懸細胞，然后上機檢測外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴細胞亞群分類及細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量。

2 結果

2.1 Tc淋巴細胞亞群分類及比值變化 模型組Tc1、Tc2百分比和Tc1/Tc2比值在治療1個月和3個月時與同組治療前比較差異無統計學意義(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)組治療3個月時Tc2細胞百分比較治療前、模型組同期和治療1個月時明顯升高(P<0.05)，而Tc1百分比和Tc1/Tc2比值降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組在治療1個月和3個月時Tc1百分比和Tc1/Tc2比值較治療前和模型組同期明顯降低(P<0.05)，而Tc2細胞百分比明顯升高(P<0.05)。且0.5 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組同期比較差異有統計學意義(P<0.05)，1 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組和0.5 mg/(kg·d)組同期比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 治療不同階段IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量變化比較 模型組IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10治療前后無明顯變化，治療1個月和3個月時與治療前比較差異無統計學意義(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)組在治療3個月時較治療前、模型組同期和治療1個月時明顯降低(P<0.05)，但IL-4、IL-10明顯升高(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組IFN-γ、IL-2在治療1個月和3個月時較治療前和模型組同期明顯降低(P<0.05)，IL-4、IL-10明顯升高(P<0.05)，且0.25 mg/(kg·d)組、0.5 mg/(kg·d)組、1 mg/(kg·d)組組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 治療前和治療1個月、3個月時Tc淋巴細胞亞群分類及比值比較(n=6，%)

注：與模型組比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05；與0.25 mg/(kg·d)組比較，△P<0.05；與0.5 mg/(kg·d)組比較，▽P<0.05

2.3 Tc淋巴細胞亞群分類及比值變化比較 模型組Th1、Th2百分比和Th1/Th2比值治療1個月和3個月時與同組治療前比較差異無統計學意義(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)組治療3個月時Th2細胞百分比升高、Th1百分比和Th1/Th2比值較治療前、模型組同期和治療1個月時降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組在治療1個月和3個月時Th1百分比和Th1/Th2比值較治療前、模型組同期和治療1個月時降低，Th2細胞百分比升高(P<0.05)。且0.5 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組同期比較差異有統計學意義(P<0.05)，1 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組和0.5 mg/(kg·d)組同期比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

系統性紅斑狼瘡是以女性多發的具有性別偏好性的自身免疫功能紊亂性疾病，男女的發病性別比為1∶7～1∶9[7]。目前，雖然對系統性紅斑狼瘡的研究相對深入，但其發病機制及病因均未完全肯定，免疫異常、內分泌失調、感染、遺傳和環境等多因素相互作用而引起患者機體免疫體系的功能失調是其發病的根本原因[8-12]。研究表明，在系統性紅斑狼瘡活動期，存在T細胞功能失調和B細胞多克隆活化現象，二者相互作用產生大量自身抗體，在與抗原結合后，形成免疫復合物沉積于組織器官，造成不同程度的免疫性損傷[13-14]。且系統性紅斑狼瘡在不同時期，患者外周血Tc與Th細胞比例失衡，特別在活動期多出現Th、Tc細胞漂移現象[15-16]。T淋巴細胞平衡是保證二者間相互協同作用、發揮正常的免疫功能、維持機體內環境穩態所必需的。T淋巴細胞由CD4+T細胞和CD8+T細胞兩個亞群組成，在骨髓的淋巴干細胞和胸腺中分化、發育成熟后，通過血液及淋巴循環遷往全身的免疫器官和組織中，二者釋放大量細胞因子和淋巴因子，發揮直接殺傷靶細胞和免疫功能。根據分泌的細胞因子和介導的免疫功能不同，CD4+細胞分為Th1、Th2兩個細胞亞群[17]。CD8+T細胞即Tc細胞，分為Tc1和Tc2兩個細胞亞群，為細胞毒性T細胞，Tc細胞能直接參與攻擊帶異抗原的腫瘤細胞、病毒感染細胞和異體細胞[18]。Th1細胞主要合成IFN-γ、IL-2，Th2細胞主要合成IL-4和IL-10，前者參與遲發型超敏反應，后者參與速發型超敏反應[19]。由此可見，CD4+T細胞和CD8+T細胞與自身免疫反應和感染性疾病密切相關，CD4+T細胞和CD8+T細胞處于相對平衡狀態，一旦平衡關系被打破，出現Tc、Th失衡(即Tc1/Tc2及Th1/Th2發生漂移)，CD4+T細胞和CD8+T細胞產生的淋巴因子或細胞因子即會產生特異性自身抗體，與自身抗原結合形成免疫復合物，從而發生自身免疫性疾病[20]。因此，阻止或抑制這種細胞漂移現象可能防止免疫功能紊亂，治療這種自身免疫性疾病。自皮質類固醇沖擊治療系統性紅斑狼瘡至今，業已證實皮質類固醇雖然治療作用顯著，但其不良反應也日漸凸顯，且新的藥物及方法又沒有突破性進展，為降低皮質類固醇沖擊依賴，減少用量及停藥后反復或復發，優化當前治療方案、研究新藥或發掘老藥藥效以減少皮質類固醇治療引起的免疫功能下降具有重要的現實意義[21]。

表2 治療不同階段IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量變化比較(n=6，pg/ml)

注：與模型組比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05；與0.25 mg/(kg·d)組比較，△P<0.05；與0.5 mg/(kg·d)組比較，▽P<0.05

表3 治療前和治療1個月、3個月時Th淋巴細胞亞群分類及比值比較(n=6，%)

注：與模型組比較，*P<0.05；與治療前比較，#P<0.05；與0.25 mg/(kg·d)組比較，△P<0.05；與0.5 mg/(kg·d)組比較，▽P<0.05

雷公藤多苷片是從中藥雷公藤中提取的生物堿，具有祛風解毒、除濕消腫、舒筋活絡、抗炎及抑制細胞免疫和體液免疫等作用，臨床已用于治療類風濕性關節炎、腎病綜合征、麻風病和系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病[22-23]。目前雷公藤多苷片治療系統性紅斑狼瘡的機制分析，多借鑒于風濕、類風濕、腎炎等的機制，而對系統性紅斑狼瘡的外周血Tc、Th細胞漂移現象的影響機制缺乏系統研究。Pristane為一類可引起各類細胞因子異常分泌并導致細胞膜非特異性炎癥反應的異抗原，肌肉或腹腔注射吸收后，可誘導多種細胞質抗原和自身核抗原形成，是目前公認的誘導系統性紅斑狼瘡的異抗原[24]。本實驗采用雷公藤多苷灌服的方法，觀察其對由Pristane誘導的BALB/c裸鼠系統性紅斑狼瘡模型外周血Tc與Th細胞漂移的影響，分析雷公藤多苷調控與系統性紅斑狼瘡發病機制密切相關的Tc與Th細胞漂移過程，為臨床治療系統性紅斑狼瘡提供理論和實驗依據。

有研究表明，IFN-γ、IL-2可能促進系統性紅斑狼瘡疾病的發展及組織器官損傷，而Th2細胞會減弱這一作用[25]。雷公藤多苷可能通過抑制Tc1細胞活化并促進Th2細胞活化，而發揮免疫調節作用。一般在系統性紅斑狼瘡活動期，Tc1細胞百分比升高、Tc2細胞百分比降低，且在系統性紅斑狼瘡發病時，出現CD4+下降、CD8+升高的現象，這在模型組中得以證實，提示Tc1/Tc2、Th1/Th2比例失衡是系統性紅斑狼瘡自身免疫損傷惡性循環及加重的重要機制。而改變或抑制T細胞漂移可能阻斷免疫應答并降低免疫損傷。本研究結果發現，0.25 mg/(kg·d)組Tc2和Th2細胞百分比、IL-4和IL-10含量較治療前、模型組同期和治療1個月時明顯升高，而Tc1和Th1百分比、Th1/Th2及Tc1/Tc2比值、IFN-γ和IL-2含量降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)組和1 mg/(kg·d)組Tc2和Th2細胞百分比、IL-4和IL-10含量在治療1個月和3個月時較治療前和模型組同期明顯升高，而Tc1和Th1百分比、Th1/Th2及Tc1/Tc2比值、IFN-γ和IL-2含量明顯降低，且0.5 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組同期比較差異有統計學意義，1 mg/(kg·d)組與0.25 mg/(kg·d)組和0.5 mg/(kg·d)組同期比較差異均有統計學意義。

綜上所述，T細胞漂移影響Pristane誘發性紅斑狼瘡病理進程，雷公藤多苷通過糾正Tc1/Tc2、Th1/Th2失衡，調節Th1和Th2分泌的細胞因子水平而影響免疫應答來治療紅斑狼瘡，且這種作用具有劑量依賴性。