活血通腑方對大鼠術后腹腔粘連巨噬細胞細胞因子的影響

王雅潔 李文林 連紫宇 馬妍婷 趙敏 楊麗麗 唐升進 王葉同 曾莉,

(南京中醫藥大學 1第二臨床醫學院，江蘇 南京 210046；2圖書館；3第一臨床醫學院；4護理學院)

腹腔粘連是腹部外傷或手術后在壁層腹膜與臟層腹膜及臟層腹膜之間形成的異常粘連〔1〕。有研究報道，90%以上的開腹手術會發生腹腔粘連〔2〕，腹腔粘連形成后可引起諸多并發癥，如慢性腹痛、不孕癥、腸梗阻等〔3,4〕，不僅給患者帶來極大的痛苦，并且增加社會負擔〔5〕。中醫認為術后腹部氣血瘀滯與腹腔粘連的形成關系密切〔6〕。經優化的活血通腑方，具有通里攻下、瀉下通腑、活血化瘀、行氣逐瘀之能。活血通腑方治療腸粘連及粘連性腸梗阻療效顯著〔7,8〕。巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，在疾病的發生發展中起重要作用，具有滅菌、吞噬病原體和分泌細胞因子等功能，同時維持體內平衡〔9〕。當受到不同因子刺激時，巨噬細胞會形成經典活化(M1)型和替代活化(M2)型巨噬細胞。受炎性微環境促炎因子刺激，巨噬細胞向M1型轉化，其分泌的細胞因子白細胞介素(IL)-1、IL-6等能夠促進炎癥反應，清除微生物，形成促炎癥反饋；被抗炎性細胞因子刺激，則轉化為M2型，M2型巨噬細胞分泌的IL-4、IL-13等可以降低炎癥反應，形成抗炎癥反應的正反饋機制〔10〕。因此通過調控巨噬細胞極化，調整免疫微環境是防治腹腔粘連的重要途徑，本實驗旨在探索活血通腑方對巨噬細胞極化表型細胞因子表達的調控作用，探究活血通腑方防治術后腹腔粘連的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性SD大鼠50只，體重(250±20)g，由上海市實驗動物中心提供，合格證號2010002609303。動物于實驗前適應性喂養，自由飲食，照明晝夜交替。

1.2儀器和試劑 活血通腑方由大黃10 g、桃仁10 g、延胡索10 g、萊菔子10 g、紅花6 g和芒硝10 g組成，均購自江西濟世堂藥業有限公司(生產批號：170106020)；四磨湯口服液購自湖南漢森制藥股份有限公司(生產批號：1607206)；氟伐他汀膠囊購自北京諾華制藥有限公司(產品批號：X1497)；生理鹽水購自山東華魯制藥有限公司(產品批號：C15082702)。酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購自南京金益柏生物科技有限公司，臺式高速冷凍離心機(型號：Allegra 64R)購自美國Beckman公司，酶標儀(型號：Victor X3)購自美國PerkinElmer公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)儀購自美國ABI StepOne Plus。TRIzol Reagent(產品批號：15596026)、逆轉錄試劑盒(產品批號：K1622)購自賽默飛世爾科技有限公司，Taq酶試劑盒(產品批號：Q341-02)購自諾唯贊生物科技有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3藥物制備 取大黃50 g、桃仁50 g、延胡索50 g、萊菔子50 g，加飲片總量15倍(3 000 ml)的70% 乙醇，回流提取2 h，分2次進行，藥液濾過，合并兩次提取液，濾液經旋轉蒸發回收乙醇，濃縮至無醇味。上述藥渣與紅花30 g合并，加飲片總量20倍水煎煮，分3次煎煮，每次煎煮1 h，藥液濾過后合并，濾液旋轉蒸發濃縮至相對密度為1.00～1.10(60℃)，藥液冷卻后，進行醇沉，加乙醇至含醇量50%，攪勻后靜置48 h，取上清液加入芒硝50 g，藥液旋轉蒸發濃縮至相對密度1.00～1.10(60℃)，4℃冷藏備用〔11〕。

1.4方法

1.4.1造模方法 使用銼刀法建立大鼠術后腹腔粘連模型。造模前，全部大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，修剪腹部皮毛，仰臥位固定于鼠板，碘伏溶液消毒后，酒精脫碘，無菌操作下前正中開口，輕輕將盲腸拉出腹腔，在盲腸端用什錦銼刀反復摩擦5 min，摩擦至表面出現針尖狀出血點，將盲腸納入腹腔，恢復原狀，逐層縫合肌肉層和表皮，75%酒精消毒。假手術組大鼠，腹部開口后，空氣中充分暴露5 min，逐層縫合傷口，酒精消毒〔8〕。

1.4.2分組及給藥 將50只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、四磨湯組、氟伐他汀組和活血通腑方組，每組10只。假手術組大鼠，腹部開口后，空氣中暴露5 min，不予造模，逐層縫合傷口。模型組、四磨湯組、氟伐他汀組和活血通腑方組常規造模，術后第2天開始灌胃給藥，灌胃藥液預熱，溫度37℃左右。四磨湯組給予四磨湯口服液，0.54 ml/100 g灌胃，1次/d，連續7 d；氟伐他汀組給予氟伐他汀膠囊生理鹽水，2 mg/kg，0.4 ml/100 g灌胃，1次/d，連續7 d；活血通腑方組給予活血通腑方水煎液，按大鼠體重1.044 g/100 g計算(等效量)，1 ml/100 g用藥量灌胃，1次/d，連續給藥7 d。模型組和假手術組均用生理鹽水灌胃，1 ml/100 g，連續7 d。

1.5觀察指標

1.5.1粘連評分 觀察造模后動物的一般情況及切口愈合狀況，術后第8天劍突下“U”形切口進腹，采取血液和粘連組織，根據Phillips分級標準〔12〕觀察組織粘連情況。0級：無粘連，計0分；Ⅰ級：少量粘連，粘連面積<20%，疏松易分，計1分；Ⅱ級：中度粘連，粘連面積<40%且≥20%，計2分；Ⅲ級：粘連廣泛，粘連面積在40%～60%，分離后局部有損傷和滲血，計3分；Ⅳ級：粘連成團，粘連面積>60%，分離困難，引起腸梗阻，計4分。

1.5.2Masson染色 取大鼠腸創面處粘連組織，放入10%甲醛溶液固定，組織脫水后，進行石蠟包埋，切片；切片脫蠟至蒸餾水；用weiger鐵蘇木精液染核10 min；鹽酸乙醇分化；用Masson復合染液染5～10 min；使用蒸餾水沖洗；磷鉬酸浸泡5 min后甩干；苯胺藍浸泡10 min，蒸餾水稍沖洗；分化液分化2次，每次30 s；使用蒸餾水沖洗2 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后樹脂封片，鏡下觀察病理改變。

1.5.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測 取實驗動物血液，全血室溫靜置1 h，-4℃過夜，離心機3 000 r/min，20 min，提取血清，按照試劑盒說明書步驟對IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-4、IL-10、IL-13細胞因子進行檢測。

1.5.4RT-PCR檢測IL-6、TNF-α、精氨酸酶(Arg)-1 mRNA表達水平 按照PCR RNA提取實驗步驟，提取粘連組織RNA，按照PCR試劑盒說明書步驟逆轉錄cDNA。引物序列：IL-6：正向5′-CCACTGCCTTCCCTACTTCA-3′，反向5′-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3′；TNF-α：正向5′-GCCAATGGCATGGATCTCAA-3′，反向5′-CCCTTGAAGAGAACCTGGGA-3′；Arg-1：正向5′-ACCCTGACCTATGCGTCATT-3′；反向5′-ATTCCCAGAGCTGGTTGTCA-3′；GAPDH：正向5′-GCTACACTGAGGACCAGGTT-3′，反向5′-CCCAGCATCAAAGGTGGAAG-3′。

1.6統計分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、秩和檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 整個實驗中，各組均無死亡。術后24 h各組一般狀態較差，活動少；術后48 h各組狀態尚可，活動量較前有所增加；術后72 h各組狀態正常，活動、飲食正常。術后切口愈合良好，無紅腫感染。

2.2Phillips分級結果 假手術組7只腹腔未見粘連形成，3只見少量粘連，疏松易分；模型組均見大片粘連，難以分離；四磨湯組、氟伐他汀組及活血通腑方組均有不同程度粘連；與模型組相比，四磨湯組、氟伐他汀組及活血通腑方組的粘連評分均有不同程度的減輕(P<0.05，P<0.01)，其中活血通腑方組和四靡湯組粘連評分降低顯著(P<0.01)。見表1。

表1 各組術后7 d Phillips分級(n=10，n)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；下表同

2.3粘連組織Masson染色結果 粘連組織鏡下呈藍色的為膠原纖維，呈紅色的為肌纖維。假手術組局部可見少量淺藍色；模型組則呈現為大片密集的深藍色，提示組織存在大量膠原纖維，粘連明顯；四磨湯組、氟伐他汀組及活血通腑方組呈現較模型組少而稀疏的淺藍色，提示膠原纖維增生較模型組減少，見圖1。

圖1 各組粘連組織Masson染色觀察(×200)

2.4ELISA檢測結果 與假手術組相比，模型組血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著增多，IL-4、IL-10、IL-13含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，活血通腑方組、四磨湯組、氟伐他汀組IL-1、IL-6、TNF-α表達顯著降低(P<0.05)，IL-4、IL-10、IL-13表達顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組IL-1、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13及TNF-α表達量

2.5RT-PCR檢測結果 與假手術組比較，模型組IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，活血通腑方組、四磨湯組、氟伐他汀組IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達量顯著降低(P<0.01)，見表3。

表3 各組IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達量

3 討 論

研究表明活血化瘀藥具有促進腸管蠕動，防止組織缺血，改善腹腔血液循環，抑制結締組織增生等西藥所無法替代的作用〔13，14〕。活血通腑方主要治療瘀血癥，特別是腹部術后瘀血癥，多用于防治術后粘連性腸梗阻，對處方進行優化〔15～17〕,形成現在的活血通腑方，其中大黃、桃仁為主藥皆入大腸經，通里攻下，瀉下通腑、活血化瘀；芒硝入胃、大腸經，瀉下潤燥軟堅；萊菔子歸脾、胃經，降氣除脹；合用理氣活血藥紅花、延胡索等增強行氣逐瘀之能。研究發現，活血通腑方能夠治療術后粘連性腸梗阻〔7〕，抑制腹腔粘連〔18，19〕，其含藥血清可降低CD40、CD40L表達，抑制單核細胞趨化蛋白-1、基質金屬蛋白酶(MMP)-9與轉化生長因子(TGF)-β的mRNA表達水平，抑制炎癥反應，減少纖維蛋白的沉積和粘連帶的形成，降低粘連的發生〔8〕。

炎癥細胞的特異性炎癥反應貫穿于整個粘連形成過程。在粘連形成過程中，巨噬細胞的自分泌和旁分泌作用會加重腹腔微環境的惡化，從而促進粘連形成〔20〕。受腹腔微環境影響，巨噬細胞可以被誘導分化成不同功能的M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞可分泌多種炎癥因子和趨化因子，例如IL-6、TNF-α等，這些細胞因子可清除微生物，促進炎癥反應〔21,22〕，導致機體正常組織的炎癥損傷〔23〕，M2型巨噬細胞分泌的IL-4、IL-13等細胞因子則具有相反的功能，可通過抗炎細胞和抗炎因子抑制促炎細胞和促炎因子，降低炎癥反應，促進組織修復〔24〕。

本研究提示活血通腑方治療后，由M1型巨噬細胞分泌出的促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α含量的降低，由M2型巨噬細胞分泌的抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13的升高，提示可以通過巨噬細胞入手來防治術后腹腔粘連。

本研究發現活血通腑方能夠防治大鼠術后腹腔粘連，與術后腹腔粘連部位的巨噬細胞關系密切，活血通腑方可以通過重塑腹腔微環境，調控腹腔巨噬細胞，誘導巨噬細胞向不同表型極化；因此，通過誘導巨噬細胞極化來觀察巨噬細胞影響術后腹腔粘連的作用機制將成為下一步研究的主要目的。