miR-139-5p在多形性膠質母細胞瘤中的表達與靶基因驗證

楊晉生 方軍超 張峰

(河南科技大學臨床醫學院 河南科技大學第一附屬醫院神經外科，河南 洛陽 471003)

多形性膠質母細胞瘤(GBM)是人類最常見的原發性惡性腦腫瘤，其5年生存率不足10%〔1〕。GBM以腫瘤細胞呈浸潤性生長為主要特征，進展迅速。近年來雖然手術、放化療技術得到長足發展，但GBM患者的預后仍沒有明顯改善。MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的非編碼小RNAs，長度為20～24個核苷酸，通過與靶基因miRNAs的3′非編碼區(UTR)結合，抑制miRNAs翻譯或促進其降解，進而在轉錄后水平調節基因表達。研究表明miRNAs參與調控多種生物學過程，包括細胞增殖與分化、細胞凋亡、發育與衰老和信號轉導等，miRNAs表達異常與多種腫瘤的發生發展、侵襲轉移和耐藥密切相關〔2〕。miR-139-5p基因定位于11q13.4，是近年來研究較多的腫瘤相關性miRNAs之一。已有研究發現，miR-139-5p在胃癌、肝細胞癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鱗癌、結直腸癌、白血病等多種腫瘤中低表達，而且miR-139-5p下調表達與轉移性腫瘤的特征顯著相關，包括低分化、包膜缺失、靜脈侵犯等〔3～5〕。因此，通常認為miR-139-5p具有類似抑癌基因的活性，然而其在GBM演進過程中的功能及機制鮮有報道〔6，7〕。本研究旨在探索miR-139-5p在GBM患者腦組織中的表達水平，通過生物信息學預測miR-139-5p的靶基因，并對其靶基因進行驗證和通路富集分析，為深入研究其在GBM中的功能和機制及靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 收集2015年10月至2017年8月河南科技大學第一附屬醫院神經外科36例GBM患者手術切除的腫瘤標本，所有標本由病理診斷證實，男23例，女13例，年齡21～69歲；14例同期腦外傷減壓切除的正常腦組織標本作為對照組，男9例，女5例，年齡23～65歲。收集術中切除的GBM腫瘤組織和減壓切除的正常腦組織，剪除電灼壞死部分，無菌生理鹽水沖洗后立即浸于液氮，-80℃保存備用。兩組性別、年齡分布上無統計學差異(P>0.05)。本研究經醫院醫學倫理學委員會批準，患者知情同意。

1.2實時定量PCR檢測miR-139-5p表達水平 參考TRIzol試劑(Invitrogen)的說明書，提取手術切除GBM腫瘤組織和正常腦組織的總RNA，-80℃保存備用。采用Nanodrop檢測總RNA樣品的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳評估RNA樣品的完整性。以質檢合格的總RNA樣品為模板，首先按照逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT(Takara)的操作說明合成一鏈cDNA，然后根據熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)的說明書配制PCR反應液，采用ABI7500實時定量PCR系統(Applied Biosystems)進行擴增分析，反應程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環40次。PCR反應所用引物由上海生工生物工程公司合成，miR-139-5p反轉錄序列5′-GTCAGAAGGAATGATGCACAGCCACTGGAG-3′;qPCR上游引物5′-TCTACAGTGCACGTGTCTCCAG-3′，下游引物5′-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3′。U6反轉錄序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；qPCR上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。U6基因作為反應內參，在擴增反應結束后記錄Ct值，重復實驗3次，每次3個復孔，采用2-△△Ct方法評估miR-139-5p的相對表達水平。

1.3miR-139-5p生物信息學分析 采用starBase〔8〕在線工具篩選miR-139-5p的靶基因，選取預測結果的交集。通過TargetScan數據庫分析miR-139-5p與靶基因的潛在結合位點。檢索miRPathDB數據庫分析miR-139-5p靶基因顯著富集的pathways〔9〕，并運用miRTargetLink工具構建miR-139-5p與其靶基因之間的交互網絡〔10〕。

1.4細胞培養 人膠質瘤細胞系U87(中科院上海細胞庫)培養在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中(Gibco)，置于37℃ 5% CO2培養箱中常規培養。

1.5螢光素酶報告實驗 通過TargetScan數據庫發現真核翻譯起始因子4γ2(EIF4G2)基因mRNA 3′UTR位點351～358是miR-139-5p的潛在結合位點，利用基因合成技術合成含該位點的DNA片段及含該位點突變體的DNA片段，分別亞克隆至pGL3報告載體(Promega)，構建pGL3-EIF4G2 3′UTR Wild和pGL3-EIF4G2 3′UTR Mut重組質粒，并經測序鑒定。將U87細胞以2×105/孔的密度接種于24孔板中培養24 h，然后參考脂質體2000試劑盒(Invitrogen)提供的操作流程，將pGL3-EIF4G2 3′UTR Wild或pGL3-EIF4G2 3′UTR Mut和miR-139-5p mimic或陰性對照Negative Control(RiboBio)共同轉染U87細胞，每組設置3個重復，培養48 h后裂解細胞，參照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)說明檢測螢光素酶的活性，實驗重復3次。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t及χ2檢驗。

2 結 果

2.1GBM患者腦組織miR-139-5p表達水平 采用Nanodrop對所提取的總RNA樣品進行純度檢測，結果可見所有RNA樣品的A260/280均在1.9～2.0，瓊脂糖凝膠電泳實驗表明RNA樣品均完整。實時定量PCR檢測結果發現，與對照組腦組織(1.00±0.09)相比，GBM患者腫瘤組織(0.41±0.12)中miR-139-5p的相對表達水平顯著下調(P<0.05)。

2.2miR-139-5p靶基因預測結果 starBase工具采用5種算法篩選miRNAs靶基因，TargetScan、PicTar、RNA22、PITA和miRanda分別預測出219、203、168、214和1 235個miR-139-5p靶基因，取其交集后共得到8個靶基因，包括EIF4G2、ETS1、PDE3A、H2AFV、FBN2、SEPT11、GALNT3和THBS1。

2.3靶基因pathway富集分析結果 通過檢索miRPathDB數據庫，發現miR-139-5p的靶基因顯著富集于胰島素樣生長因子(IGF)-1信號通路、神經營養因子(NGF)通路、趨化因子通路、T細胞受體通路、Ras信號通路和轉化生長因子(TGF)-β信號通路等(表1)。為了明確miR-139-5p與眾多靶基因之間的關系，我們運用miRTargetLink構建了miR-139-5p與其靶基因的交互網絡，如圖1所示，IGF1R、NOTCH1、ROCK2、PIK3CA、JUN、MCL1等屬于有實驗數據支持已證實的miR-139-5p靶基因，且與多個富集通路相關，可能是miR-139-5p發揮功能的主要分子機制。

表1 miR-139-5p靶基因pathway富集分析結果

圖1 miR-139-5p與其靶基因之間的交互網絡

2.4miR-139-5p靶向調控EIF4G2基因表達 通過starBase工具的5種算法篩選miR-139-5p的靶基因，并結合系統性文獻檢索，最后選擇EIF4G2基因作為進一步研究的目標。通過檢索TargetScan數據庫發現EIF4G2基因mRNA 3′UTR位點351～358是miR-139-5p的可能結合位點，為了證明其靶向調控關系，我們構建了EIF4G2 3′UTR Wild和EIF4G2 3′UTR Mut報告基因質粒，序列見圖2。

螢光素酶報告系統檢測結果顯示，與pGL3-EIF4G2 3′UTR Wild和miR NC共轉染組相比，pGL3-EIF4G2 3′UTR Wild和miR-139-5p mimic共轉染組螢光素酶活性顯著下降(P<0.01)；而與對照組相比，pGL3-EIF4G2 3′UTR Mut和miR-139-5p mimic共轉染組螢光素酶活性下降不明顯(P>0.05)(圖3)。由此說明，EIF4G2是miR-139-5p的靶基因，miR-139-5p可直接結合EIF4G2 3′UTR，進而負性調控報告基因的表達。

圖2 重組質粒的測序

1)P<0.01圖3 螢光素酶報告實驗證實miR-139-5p靶向調控EIF4G2基因表達

3 討 論

miR-139基因位于磷酸二酯酶2A基因的第2個內含子中，miR-139-5p是由miR 139前體所產生的成熟體之一。前期研究發現miR-139-5p在結直腸癌、肝細胞癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、卵巢癌、膀胱癌等多種腫瘤中低表達，因此，通常認為miR-139-5p屬于腫瘤抑制性miRNA〔3，11，12〕。本研究實時定量PCR結果表明，與對照組正常腦組織相比，GBM患者腦組織中miR-139-5p的相對表達水平顯著下調，提示miR-139-5p可能與GBM的發生發展相關。Dai等〔6〕通過實時PCR檢測發現，與正常人膠質細胞相比，miR-139-5p在多種GBM細胞系中顯著低表達，在12例GBM腦組織中也呈低表達。Li等〔7〕分析TCGA數據庫相關數據后發現，與正常腦組織相比，miR-139-5p在GBM腦組織中的平均表達水平顯著下調。Yuan等〔13〕結合miRStarTM腫瘤特異性miRNA芯片和實時定量PCR發現，與GBM短期生存患者(<450 d)相比，miR-139-5p在長期生存患者(>450 d)的表達水平顯著上調。Bo等〔14〕分析了12例原發GBM患者和12例復發GBM患者的miRNA轉錄譜，發現miR-139-5p在復發GBM樣本中表達下調，表明miR-139-5p的低表達可能促進GBM復發。因此，miR-139-5p在GBM發生發展及預后轉歸等過程均發揮著功能。由于miRNAs的調控機制具有“一對多”和“多對一”的復雜特征，因此，采用生物信息學方法篩選并鑒定miRNAs靶基因，對后續具體作用機制的研究提供重要參考。本研究采用starBase工具中的TargetScan、PicTar、RNA22、PITA和miRanda多種預測工具對miR-139-5p的靶基因進行篩選并取交集，提高了預測結果的可靠性，并結合文獻檢索，最后選擇EIF4G2基因作為進一步分析的目標。螢光素酶報告系統檢測結果表明，miR-139-5p可直接結合EIF4G2 3′UTR，進而負性調控EIF4G2的表達。前期研究發現miR-139-5p通過抑制EIF4G2降低整體的蛋白合成，卻特異性誘導細胞周期抑制蛋白p27Kip1翻譯，進而抑制CD34+造血干細胞和前體細胞的增殖，干擾粒單核細胞的分化，在髓系白血病發生發展中發揮作用〔15〕。Dai等〔6〕研究發現膠質瘤細胞U87MG和T98G轉染miR-139-5p后，增殖能力下降、凋亡增加，S期細胞比例增加，G0/G1期細胞比例下降；Western印跡顯示在miR-139-5p過表達的細胞中，ELTD1蛋白水平顯著下降。因此，miR-139-5p過表達抑制膠質瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡，可能與下調ELTD1蛋白和調節細胞周期有關。Li等〔7〕研究表明miR-139-5p在膠質瘤中下調Mcl-1表達水平，miR-139-5p過表達能夠抑制增殖，增強替莫唑胺所誘導的凋亡。Yue等〔16〕發現在GBM中miR-139-5p直接靶向調控ZEB1和ZEB2轉錄因子，miR-139-5p的下調引起ZEB1和ZEB2過表達，進而促進膠質瘤細胞的侵襲與轉移；miR-139-5p過表達能夠抑制GBM細胞侵襲與轉移。進一步的生物信息學分析結果表明miR-139-5p靶基因涉及多個與腫瘤發生相關的信號通路，提示其參與調控腫瘤的發生發展過程。miR-139-5p表達下調引起靶基因異常，進而通過調節細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期、細胞侵襲與轉移等影響多種腫瘤的進程，與其發生發展和預后等密切相關〔5〕。目前miR-139-5p在GBM演進過程中的分子機制尚未闡明，相關研究值得探討。