記憶性T細胞在腫瘤免疫治療中的研究進展①

張 震 張 毅

(鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心，鄭州450052)

免疫治療已經成為癌癥治療中最具有應用前景的一種策略，并在臨床試驗中展現出了較好的療效。尤其是基因工程化T細胞能夠特異且有效殺傷腫瘤細胞，為實體瘤患者的治療帶來新的希望[1]。然而，無論是傳統的免疫細胞療法還是新型的嵌合抗原受體 T 細胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)及T細胞受體T細胞(T-cell receptor T cells,TCR-T)治療，均是基于終末分化效應T細胞，使其難以在體內發揮持久的抗腫瘤效應[2]。已有研究表明，過繼輸注的年輕化T細胞能夠在小鼠體內自我更新及分化,具有長期存活的能力，并展示出顯著優于終末分化的效應T細胞的抗腫瘤能力[3-5]。這些研究提示，低分化狀態的免疫細胞在臨床治療中可能更具有應用潛力。

記憶性T細胞是一群異質性的細胞亞群，在腫瘤免疫應答和免疫記憶維持中發揮重要作用[6]。由于分化程度的不同使T細胞亞群在生物學特征和抗腫瘤效應等方面存在顯著差異。記憶性T細胞的分化受到多種因素如轉錄因子、細胞因子、代謝檢查點及microRNA(miRNA)等的調控[7,8]。因此，探究T細胞分化過程及如何在體外擴增出更多年輕化、抗腫瘤能力強的免疫細胞使腫瘤患者受益是目前國內外研究的熱點。本文將從記憶性T細胞的表型、功能、分化機制及臨床轉化應用等方面進行深入探討，以期為免疫治療提供新的思路。

1 記憶性T細胞的表型與特征

記憶性T細胞起源的研究基于Youngblood等[9]研究團隊的成果， 他們利用小鼠感染模型證實了初始T細胞(na?ve T cell,Tn)在受到病原體感染時迅速獲得效應功能分化為效應T細胞(effector T cell,Teff)。大部分Teff細胞在清除病原體后凋亡，但仍存在一小部分長壽命的記憶性T細胞亞群，再次發生感染時，這群細胞能夠快速增殖分化。隨著記憶性T細胞分化程度的增加，其自我更新和存活能力逐漸下降[10]。根據細胞表面趨化因子受體(CCR7)和淋巴結歸巢分子(CD62L)將記憶性T細胞分為中心記憶性T細胞(central memory T cell,Tcm)和效應記憶性T細胞(effector memory T cell,Tem)[11]。Tcm細胞表型為CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-，由于其高表達CCR7和CD62L分子而具有快速增殖和分化的特征，能夠歸巢至次級淋巴器官。Tem細胞表型為CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-，具有較強的溶細胞功能，可遷移至炎癥組織中迅速發揮效應功能。Villani等[12]通過基因表達譜發現Tcm細胞高表達Eomes、TCF-1、FOXP1等早期分化相關基因，而Tem細胞高表達Tbx21、PRDM1、Granzyme等效應相關基因，提示不同記憶亞群T細胞其表型和基因表達譜具有差異性。

最近研究發現在靈長類及人類的外周血中存在一群比例較低的干細胞樣T細胞(stem memory T cell,Tscm)[13]。隨著Tscm細胞的發現，研究者對T細胞線性分化模式進行了深入研究：Tn-Teff-Tscm-Tcm-Tem-Teff[14]。Gattinoni等[15]采用流式細胞術對人外周血中Tscm表型進行鑒定，發現這群細胞同時具有Tn和Tcm細胞的一些共有表型，即表達CD45RO-CD45RA+CCR7+CD62L+CD95+，歸巢于淋巴結。同時，Tscm細胞高表達IL-2Rβ(CD122)、IL-7Rα(CD127)、CD28和CD27等與T細胞早期分化相關的分子，低表達CD57和KLRG-1等與T細胞衰老相關的標志物[15]。Tscm細胞具有較強的自我更新能力，能夠在體內發揮長期抗腫瘤效應，是免疫細胞治療中最具有應用前景的細胞亞群。

2 記憶性T細胞的臨床意義和功能

記憶性T細胞在患者外周血及腫瘤微環境中的比例與預后密切相關，能夠作為提示單抗治療及化療等的療效指標。在57%惡性黑色素瘤患者中發現外周血CD45RO+CD8+T細胞的比例顯著低于正常水平，這群患者對PD-1單抗治療無效，而外周血中含有較高水平記憶性T細胞的患者能夠對單抗治療有效，提高其生存期[16]。在非小細胞肺癌患者中，腫瘤組織浸潤的CD45RO+CD8+T細胞比例與患者預后呈正相關[17]。Lieben等[18]報道了在惡性卵巢癌患者腹水中的巨噬細胞大量產生CXCL9，通過與其受體CXCR3結合招募Tem細胞，進一步檢測外周血與腹水中Tn、Tcm、Tem和Teff細胞亞群，發現Tem細胞比例顯著增加且提示患者具有較好的預后。因此，記憶性T細胞在患者腫瘤微環境中的浸潤是評估其預后的重要指標之一。

不同亞群T細胞在分泌細胞因子及抗腫瘤免疫中發揮不同的作用。傳統選擇過繼性輸注的T細胞是根據其能否產生大量IFN-γ和特異性殺傷靶細胞。在體外試驗中發現Tem細胞分泌IFN-γ的水平較高，其清除抗原能力強，可以作為免疫細胞治療的亞群。但是將Tscm、Tcm和Tem細胞分別過繼輸注至小鼠體內后，約60%的Tscm細胞能夠維持其表型，僅有30%的Tcm細胞維持其細胞表型，而Tem細胞快速進入終末分化階段[15]。因此，Tem細胞在體內的存活能力及殺傷效果較差。Tcm細胞能夠引起腫瘤的消退，其體內殺傷功能顯著優于Tem細胞。Tscm細胞分泌IL-2的水平較高、具有干性和分化為其他記憶亞群的特性，使其在淋巴結和非淋巴組織中均具有較強的增殖能力，并在小鼠體內長期存活。Nicoletta等[19]報道了通過體外分選健康供者Tn 細胞，采用 CD3/CD28 beads 活化后加入 IL-7 和 IL-15 等細胞因子進行培養，能夠誘導產生大量表達 CD45RA、CD95、CCR7和CD62L 的Tscm細胞。同時將體外誘導的各亞群T細胞輸注至免疫缺陷小鼠體內，發現Tscm細胞能夠顯著延長小鼠生存期。這些結果說明Tscm細胞抗腫瘤活性及體內生存能力均優于其他亞群。

3 調控記憶性T細胞分化的機制

免疫治療成功的一個關鍵因素是獲得免疫記憶性，即輸注的T細胞亞群能夠在體內維持自我更新和分化，從而有效殺傷腫瘤細胞。已有文獻報道在Tn細胞分化為記憶性T細胞的過程中具有可塑性并受到多種因素的調控。因此，明確影響T細胞分化的機制，對體外獲得更多年輕狀態T細胞并用于免疫細胞治療非常重要。以下，我們將重點逐一分析轉錄因子、細胞因子、代謝檢查點和miRNA等在調控記憶性T細胞分化中的作用。

3.1轉錄因子 隨著二代測序技術的普及，T細胞分化過程中重要的轉錄因子逐漸被發現，它們在調控記憶性或效應性T細胞相關基因表達中發揮重要作用。在記憶性T細胞分化為Teff的過程中，多種轉錄因子如脫中胚蛋白(Eomesodermin,Eomes)、T細胞轉錄因子(T cell factor-1,TCF-1)、淋巴增強轉錄因子(Lymphoid enhancer-binding factor-1,LEF-1)及人runt相關轉錄因子3(human runt-related transcription factor 3,Runx3)的表達逐漸下降，而T-bet及B 淋巴細胞誘導成熟蛋白-1(B lymphocyte-induced maturation protein 1,Blimp-1)的表達水平增加[20,21]。其中Eomes和T-bet能夠調節T細胞發育和自穩態平衡[22]。T-bet屬于T-box家族成員，主要功能是通過上調KLRG-1的表達促進T細胞向終末狀態分化。小鼠實驗發現IL-12能夠誘導T-bet的表達，產生一群表型為IL-7RloKLRG-1hi的終末分化前體細胞。敲除小鼠T-bet基因后，可誘導T細胞高表達IL-7R并向記憶前體細胞分化[23]。Knudson等[24]報道了Eomes 在記憶性T細胞上高表達且是Tcm細胞表型維持的關鍵因子。進一步研究發現，采用NF-κB抑制劑處理T細胞后降低了Eomes的表達水平，說明NF-κB通路活性能夠維持記憶性T細胞Eomes的表達。有研究發現，TCF-1和LEF-1在記憶性T細胞高表達，能夠維持其自我更新能力，且淋巴結中TCF-1表達水平顯著高于其他組織，表明TCF-1是記憶性T細胞的特征性標志物[25]。Runx家族的3個成員Runx1、Runx2和Runx3是調控T細胞發育的重要轉錄因子[26]。其中，在Runx3敲除小鼠模型中發現外周CD8+T細胞比例顯著下降，其增殖能力也降低。此外，Runx3能夠調控組織記憶性CD8+T細胞的分化與自穩態[27]。在惡性黑色瘤小鼠模型中輸注高表達Runx3的T細胞能夠減緩腫瘤生長，延長小鼠生存期。因此，記憶性T細胞的分化受到多種轉錄因子的調控，然而不同轉錄因子之間的相互作用有待進一步研究。

3.2細胞因子 大量文獻表明，在免疫細胞培養體系中添加不同細胞因子可使其向記憶性或效應性T細胞分化。已有研究證實IL-2誘導T細胞向Teff分化，而IL-7、IL-15及IL-21等能夠誘導記憶性T細胞分化[28]。IL-7屬于促紅細胞生成素家族Ⅰ型短鏈細胞因子，主要在適應性免疫中發揮作用。IL-7與其受體 IL-7R 結合后對T細胞的穩態及記憶性維持方面的功能已經較明確，但相關機制仍需進一步探究[29]。IL-15 能夠誘導 T 細胞的活化、延長其生存時間。同時，IL-15誘導產生具有高親和性的抗原特異性T細胞并維持其記憶性。IL-15與其受體 IL-15R 結合后激活免疫細胞 STAT3 和 STAT5 通路,并招募下游 PI3K 或 AKT 的活化，從而促進T細胞的增殖[30]。在體外，IL-7和IL-15聯合誘導產生Tscm細胞，為過繼細胞免疫治療提供具有較強抗腫瘤活性的細胞亞群。IL-21與IL-15結構相似，通過誘導早期分化的表型對 Tcm 細胞的維持和發育起到重要作用。同時，IL-21誘導的記憶性細胞與CTLA-4單抗聯合后可以應用于臨床患者的治療[31]。目前，采用小分子化合物如TWS119及雷帕霉素等能夠在體外誘導記憶性T細胞。在我們的研究中，使用了IL-7、IL-15或IL-21與TWS119聯合培養免疫細胞，采用流式細胞術檢測細胞記憶表型發現IL-7+IL-21+TWS119組合顯著促進Tscm和Tcm細胞形成，并降低PD-1和Tim-3的表達水平。與單獨TWS119或聯合其他細胞因子組相比較，IL-7和IL-21增強了CD8+T細胞分泌促炎性細胞因子的能力并抑制了T細胞的凋亡。然而，采用細胞因子與藥物聯合促進記憶性T細胞分化的機制仍有待研究。

3.3代謝檢查點 T細胞在分化過程中發生了代謝重編程，即Tn細胞由于能量需求低主要通過氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)獲得ATP。Teff細胞處于活化狀態主要通過糖酵解(Glycolysis)方式獲得營養物質使T細胞快速增殖、清除腫瘤細胞。Teff細胞分化為記憶性T細胞后其線粒體呼吸增加，轉化為脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation,FAO)和氧化磷酸化[32]。在腫瘤微環境中，腫瘤細胞通過競爭性利用糖酵解抑制T細胞的代謝重編程，使記憶性T細胞形成受到抑制。越來越多的證據表明了代謝對T細胞分化影響的重要性，發現T細胞代謝受到檢查點AMPK、mTOR、Myc 和 HIF-1α的調控[8,33-35]。AMPK是結構上高度保守的蘇氨酸/絲氨酸激酶的異源三聚體復合物，影響胞內AMP 和ATP 的水平。當AMP/ATP升高時，激活AMPK從而降低T細胞糖酵解水平、增加其氧化磷酸化水平[36]。二甲雙胍作為AMPK的激活劑能夠顯著抑制腫瘤細胞生長、提高患者的生存期[37]。Eikawa等[38]報道了服用二甲雙胍的小鼠移植瘤模型中腫瘤生長受到抑制，同時發現腫瘤浸潤性T細胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)數目增加、耗竭性表面標志物表達水平下調，從而促進記憶性T細胞產生并增強其殺傷腫瘤的能力。因而，二甲雙胍能夠影響體內記憶性T細胞分化，為優化培養體系提供較好的策略。mTOR、Myc和HIF-1α主要調控T細胞的糖酵解，促進Teff分化。已有文獻報道采用mTOR抑制劑雷帕霉素處理T細胞后促進Tscm的產生，降低2-NBDG的表達水平，使T細胞糖酵解受到抑制。相反的，mTOR的活化能夠促進myc和HIF-1α的表達，進一步上調糖酵解相關基因Glut-1和限速酶HK2的表達，從而使T細胞糖酵解水平增加，影響記憶性T細胞的分化[39]。我們的研究發現，抑制Glut-1的表達可增加T細胞的氧化磷酸化水平，同時促進Tcm細胞形成[40]。因此，靶向代謝檢查點可以使T細胞向記憶性分化，為免疫治療提供更多年輕狀態的T細胞。

3.4miRNA miRNA 是一類內源性平均長度約為18～24個核苷酸的非編碼小分子 RNA，在基因翻譯后修飾調控中發揮重要作用。研究表明在 T 細胞中敲低miRNA成熟密切相關的 Dicer 酶的表達能夠影響 T 細胞活化與增殖，提示 miRNA 對 T 細胞分化至關重要[41-43]。miRNA的表達譜隨著記憶性 T 細胞形成發生了顯著變化。在我們的報道中，采用熒光定量PCR檢測了Tn、Teff和記憶性T細胞(Tm)上34種miRNA的表達，通過篩選發現miR-143在Tn和Tcm細胞中高表達，而在Teff細胞中低表達。進一步研究發現，miR-143通過靶向Glut-1抑制其表達，從而降低T細胞糖酵解水平，促進Tcm的形成。同時，我們檢測發現miR-143在食管癌患者腫瘤組織中表達水平顯著低于癌旁組織，而Glut-1在癌組織中顯著高表達。通過分析腫瘤微環境中免疫抑制因素，我們發現IDO能夠抑制miR-143的表達，使腫瘤組織中浸潤的記憶性T細胞比例減少。然而，IDO如何通過調控miR-143表達進而影響患者體內記憶性T細胞形成還有待進一步研究[40]。此外，有文獻報道miR-28能夠降低腫瘤微環境中耗竭性標志物PD-1的表達并改善T細胞功能，提示miR-28在逆轉耗竭性T細胞分化為記憶性T細胞方面具有重要作用，但其具體機制尚不清楚[44]。同時，有研究表明miR-17-92家族成員通過調控PI3K-AKT-mTOR信號通路促進效應T細胞分化。在小鼠模型中通過敲除miR-17-92家族能夠促進記憶性T細胞的分化[45,46]。此外，多種miRNA如miR-21、miR-23 及miR-155等參與調控T細胞的功能獲得與分化[43]。因此，miRNA能夠通過調控基因表達及信號通路活性影響T細胞分化，為免疫治療提供新的靶點。

4 記憶性T細胞與免疫治療的關系

以靶向 CD19 為代表性的 CAR-T 細胞治療兒童及成人復發難治性急性淋巴細胞白血病的完全緩解率(Complete remission,CR)可達 90%以上[47,48]。基于CAR-T細胞在血液系統腫瘤治療中取得的良好療效及大量臨床試驗的安全評估，美國 FDA 已于 2017 年批準 Kymriah 和 Yescarta 兩種類型的 CAR-T 細胞作為藥物上市。CAR-T細胞在血液系統腫瘤治療中獲得成功的關鍵因素之一是患者體內能夠形成記憶性T細胞。Sabatino等[49]的研究團隊在體外培養過程中獲得了大量臨床級別的干細胞樣CAR-T細胞，主要是采用TWS119聯合IL-7和IL-21等細胞因子的培養體系擴增出表型為CD8+CD45RO-CCR7+CD45RA+CD62L+CD27+CD95+的CAR-T細胞。在小鼠白血病移植瘤模型中，輸注干細胞樣CAR-T細胞能夠發揮持久的抗腫瘤效應。Ghassemi等[50]通過收集第3天～第5天和第9天的CAR-T細胞，比較其分化狀態及抗腫瘤活性，發現縮短CAR-T細胞培養時間可以獲得較多低分化狀態的細胞亞群，在體內具有較強的抗腫瘤活性。然而，CAR-T細胞在治療實體瘤方面進展緩慢，接受靶向表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的 CAR-T 細胞治療后，僅 18.18% 的晚期肺癌患者出現部分緩解，其余患者均無反應[51]。TCR-T細胞在實體瘤治療中具有較好的臨床應用前景，但是由于腫瘤微環境的免疫抑制作用及體外經TCR基因轉染的T細胞處于終末分化狀態等使很多患者無法受益[52]。因此，體外通過采用細胞因子及小分子化合物TWS119等方案誘導Tscm亞群或通過靶向代謝檢查點獲得大量Tcm細胞亞群是目前提高免疫治療療效的有效手段。同時，將抗原特異性TCR基因或者CAR載體轉染至Tscm或Tcm亞群，獲得能夠在體內發揮持久抗腫瘤效應的基因工程化T細胞并輸注給患者也會為細胞免疫治療帶來更好的效果(圖1)。一項臨床試驗研究發現，基因改造后的Tscm在體內存活長達12年，并具有良好的安全性和功能[53]。綜上所述，Tscm和Tcm細胞亞群在臨床抗腫瘤免疫治療中具有較好的臨床應用前景，可以為改善患者預后提供個性化的治療方案。

圖1 記憶性T細胞亞群在腫瘤免疫治療中的作用

5 總結與展望

免疫治療已經成為腫瘤治療的重要手段，而獲得具有免疫記憶性的T細胞能夠增強治療的持久性和有效性。不同亞群記憶性T細胞可根據其表面標志物、基因表達譜及代謝方式等進行鑒定。在臨床前試驗中已經證實體內記憶性T細胞的形成可以顯著抑制小鼠腫瘤生長，延長其生存期。同時，通過體外誘導培養可獲得臨床級別的記憶性T細胞。但仍存在許多問題需要解決：(1)闡明維持記憶性T細胞表型的相關分子機制及表觀遺傳修飾的影響；(2)部分患者由于免疫狀態低下難以獲得足夠數量的免疫細胞進行誘導培養；(3)輸注的免疫細胞易受到微環境的抑制難以發揮抗腫瘤效應。如何清除腫瘤微環境中的抑制因素如髓源性抑制細胞(MDSC)、巨噬細胞(Macrophage)及調節性T細胞(Treg)等，使記憶性T細胞能夠達到腫瘤部位并殺傷腫瘤細胞是目前值得關注的重要科學問題。同時，值得注意的是單一的治療方式并不能有效清除腫瘤細胞，應將免疫細胞治療與PD-1單抗、CTLA-4單抗或放、化療等治療方式相結合，從而使患者獲得更好的療效。綜上所述，記憶性T細胞顯示了優越的臨床應用潛能，我們堅信其會在未來的免疫治療中發揮重要作用。