日本血吸蟲感染小鼠的髓源抑制細胞對T細胞的免疫抑制①

高勇強 黎 麗 胡 麗 梁 瑜 曹勁松 肖建華

(特殊病原體防控湖南省重點實驗室，南華大學病原生物學研究所,衡陽421001)

血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種呈世界性分布、嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病[1]。在血吸蟲感染小鼠模型中，既有以Th1細胞為主的保護性免疫應答，又有以Th2細胞為主的病理性免疫應答，兩者之間維持著動態的免疫平衡[2,3]。近年來研究發現，在荷瘤小鼠骨髓、脾臟、血液和腫瘤組織,以及腫瘤患者外周血和腫瘤組織中，廣泛存在著一群髓系來源抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)，這些細胞來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞，形態幼稚，以幼稚粒細胞(MDSC-G)和幼稚單核細胞(MDSC-M)為主，其共同的表面標志為Gr-1+CD11b+，具有強大的免疫抑制和廣泛的免疫調節功能，如抑制CD4+T細胞增殖和抗原特異性CD8+T細胞分泌IFN-γ等，與腫瘤免疫逃逸和免疫耐受密切相關[4,5]。在寄生蟲感染中，有關 MDSCs 的研究，近幾年也有少量報道[6,7]。例如弓形蟲、克氏錐蟲、碩大利什曼原蟲和牛帶絳蟲感染宿主后，宿主體內 MDSCs 大量增殖，肺部、外周血液和腹腔積液中 MDSCs 細胞數量也明顯增多，且呈現抑制宿主的免疫應答的作用。為了研究在日本血吸蟲感染小鼠體內誘導產生的 MDSCs 細胞是否具有免疫抑制功能及其作用機制，我們通過構建血吸蟲感染小鼠模型來研究MDSCs對血吸蟲感染的免疫抑制作用和探討可能的作用機制，為血吸蟲防治探索新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料 60只6～8周，18～22 g，SPF級飼養的健康BALB/c小鼠，購自長沙史萊克景達實驗動物有限公司。血吸蟲尾蚴陽性釘螺購自岳陽市血吸蟲病防治研究所。Percp-Cy 5.5 conjugated Rat Anti-Mouse CD11b antibody、APC conjugated Rat Anti-Mouse Gr1 antibody、PE conjugated Rat Anti-Mouse Gr1 antibody，以上抗體購自美國BD Bioscience公司。Anti-biotin-APC、CD4+T cell isolation kit(mouse)、CD11b+cell isolation kit(mouse)、CD8+T cell isolation kit(mouse)，以上試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司。Dynabeads Mouse T-Activator CD3/28購自美國Invitrogen公司。BD FACSLysing Solution購自美國BD Biosciences公司。TaqMan?IL-10、IL-4、精氨酸酶Ⅰ(Arginase Ⅰ,AngⅠ)、NOS2、IL-13、IFN-γ、TNF-α molecule probe均購自美國Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1日本血吸蟲感染小鼠模型的構建 60只BALB/c小鼠隨機分為安慰劑組(無尾蚴的生理鹽水，10只)，正常對照組(10只小鼠)和感染組(尾蚴感染組40只)；采用尾蚴腹部敷貼法構建日本血吸蟲病小鼠模型。

1.2.2流式細胞術檢測模型小鼠體內各個時間點MDSCs的動態比例變化 感染組小鼠分別在第2、4、8、12、16、20周等6個時間點，采用乙醚吸入麻醉，無菌操作摘取小鼠眼球采血，拉頸處死小鼠，分別取骨髓、肝臟和脾臟組織，研磨過濾制備單細胞懸液，流式細胞術檢測小鼠體內MDSCs的比例變化。

1.2.3模型小鼠骨髓MDSCs粒系和單核系亞群的免疫磁珠分選及形態學分析 將模型小鼠處死后，無菌操作游離小鼠的股骨和脛骨，剪斷兩端骨骺，用staining buffer 沖洗出骨髓，制備單細胞懸液。取100 ml staining buffer 重懸106單細胞，加入CD11b抗體和Gr1抗體，然后用流式細胞儀分析和分選。將流式細胞儀(BD FACS Aira)分選出的骨髓初始MDSCs亞群分別取50 000個細胞進行離心涂片，用Wright-Giemsa染色進行形態學分析。

1.2.4模型小鼠骨髓MDSCs亞群對CD4+或CD8+T細胞增殖的影響 流式細胞儀分選出正常小鼠脾臟的CD4+T細胞、CD8+T細胞，CFSE法標記，將從模型小鼠骨髓MDSCs細胞中分選出的粒系和單核系亞群細胞分別與其共培養72 h，流式細胞儀檢測CFSE染色的增殖峰，以評價粒系和單核系兩個亞群分別抑制T淋巴細胞增殖的能力。

1.2.5Real-time PCR檢測模型小鼠骨髓MDSCs亞群相關細胞因子及ArgⅠ、NOS2 mRNA的表達 用實時定量PCR法(Real-time PCR)，檢測IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1等細胞因子以及ArgⅠ、NOS2兩種酶在骨髓MDSCs亞群細胞中的mRNA表達水平。以GAPDH mRNA的表達為內參照。Real-time PCR引物由上海生工合成，Mouse IL-4：sense 5′-CATGGAGCTGCAGAGACTCTTT-3′，antis-ense 5′-TGCATGATGCTCTTTAGGCTTTC-3′；Mouse IL-10：sense 5′-ATTTGAATTCCCTGGGTGA-GAAG-3′，antisense 5′-CACAGGGGAGAAATCGATGACA-3′； Mouse IL-13：sense 5′-GTCCCTGGTGTTCTTCCT-GATAC-3′，antisense 5′-CAGCACTACAGAGTCGG-TTTCC-3′；Mouse TGF-β：sense 5′-TGATACGCCTGAGTGGCTGTCT-3′，antisense 5′-TTTGCTGTCACA-AGAGCAGTGA-3′；Mouse IFN-γ：sense 5′-GGCACAGTCATTGAAAGCCTAGA-3′，antis-ense 5′-GTCACCATCCTTTTGCCAGTTC-3′；Mouse ArgⅠ：sense 5′-TGTGGTGGCAGAGGT-3′，antisense 5′-GAGGGACGTATAGACG-3′；Mouse NOS2：sense 5′-TCCATGC-TAATGCGAAAG-3′，antisense 5′-ATGCGGAAGTTGTGG-3′；Mouse GAPDH：sense 5′-TGGAGAAACCTGCCAA-GTATGA-3′，antisense 5′-CTGTTGAAGTCGCAGGAG-ACAA-3′。

2 結果

2.1流式細胞術檢測小鼠體內MDSCs 正常對照組小鼠與安慰劑組相比，MDSCs累積無顯著差異，表明外界飼養環境及安慰劑處理不會導致小鼠的MDSCs累積(圖1)。而連續監測日本血吸蟲感染小鼠在第2、4、8、12和16周骨髓、脾臟、肝臟和外周血的MDSCs，可見比例不斷增加，在第8周達到高峰，至第20周時仍維持在較高水平(圖2)。

圖1 正常組和安慰劑組小鼠不同組織器官MDSCs的比例

2.2日本血吸蟲感染模型小鼠骨髓MDSCs粒系(G)和單核系(M)亞群的免疫磁珠分選 通過磁珠分選法從小鼠骨髓MDSCs中分離純化CD11b細胞后，并運用流式細胞技術分析純化細胞中CD11b和Gr1細胞含量。結果發現所分離的細胞中MDSCs細胞含量約為99%，其中CD11b+Gr1+雙陽性細胞占比94.5%。進一步通過ly6C抗體分選出CD11b+Gr1+亞群中單核系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6C+)亞群(M亞群)和粒系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6C-)亞群(G亞群)(圖3)。

圖3 小鼠骨髓MDSCs粒系(G)和單核系(M)亞群的磁珠分選

圖2 日本血吸蟲感染模型小鼠體內MDSCs的動態比例變化

圖4 模型小鼠骨髓MDSCs亞群細胞的形態學分析(Bar=50 μm)

圖5 不同濃度MDSCs亞群對CD4+T和CD8+T細胞的增殖抑制作用

圖6 血吸蟲感染模型小鼠中相關細胞因子和酶基因的mRNA表達

2.3日本血吸蟲感染模型小鼠骨髓MDSCs粒系和單核系亞群細胞的形態學鑒定 將分離純化的模型小鼠骨髓MDSCs亞群用Wright-Giemsa染色，鏡下顯示G亞群細胞體積較大，表現為環形核和分葉核的幼稚粒細胞，核質較大；M亞群細胞體積較小，表現為圓形核和橢圓形核的幼稚單核細胞，核質較大。見圖4。

2.4血吸蟲感染模型小鼠在第8周時骨髓MDSCs粒系和單核系亞群對CD4+T和CD8+T細胞的增殖抑制 采用細胞內熒光染料CFSE標記正常小鼠脾CD4+T細胞和CD8+T細胞，預先用Dynabeads CD3/28-T-Activator 活化CD4+T細胞、CD8+T細胞，取血吸蟲感染模型小鼠體內MDSCs在第8周時的累積高峰，與骨髓MDSCs粒系(BM-G)和單核系(BM-M)亞群共培養，72 h后，流式檢測CFSE染色的增殖峰，發現骨髓MDSCs細胞中G亞群和M亞群均能不同程度地抑制CD4+T細胞、CD8+T細胞的增殖；并且隨著共培養體系中G細胞和M細胞數量比例增加而抑制作用逐漸增強(圖5)。

2.5血吸蟲感染模型小鼠在第8周時骨髓MDSCs的相關細胞因子及ArgⅠ、NOS2兩種酶的實時定量PCR檢測 Real-time PCR方法檢測模型小鼠在第8周時骨髓MDSCs 細胞的抑制性細胞因子及NOS2、ArgⅠ的基因表達水平。與正常組對照，其差異有統計學意義(圖6)。

3 討論

在各種不同的腫瘤或感染動物模型中，骨髓、血液、脾臟及腫瘤部位均會有MDSCs的增加[8，9]，在寄生蟲感染中，有關 MDSCs 的研究，近幾年也有少量報道[6，7]。為此本實驗構建了日本血吸蟲感染BALB/c 小鼠模型，來研究MDSCs在寄生蟲感染中的免疫抑制作用。本研究分離制備出模型小鼠骨髓、脾、肝、血4種組織的單細胞懸液，流式細胞術檢測MDSCs在第2、4、6、8、12、16、20周的動態比例變化，與對照組正常小鼠骨髓、脾、肝、血液等組織中的CD11b+Gr-1+表型的MDSCs細胞相比較；發現在4種組織中MDSCs細胞均有不同比例的升高，尤其在血吸蟲病的慢性期(肉芽腫病變期)升高顯著。表明在血吸蟲感染病程中，骨髓MDSCs大量積聚到外周器官參與抑制機體免疫反應，避免過度免疫反應對重要臟器的損害，以實現對機體的保護。

為了進一步認識MDSCs細胞，本研究對分選出的MDSCs細胞進行了形態學分析，通過免疫磁珠分離方法分離出的CD11b+細胞中約有97%共表達CD11b和Gr-1表型(圖1)。形態學上可看到這些細胞形態大小不一，胞質呈淡藍色，細胞核呈分葉形、環形、橢圓形和多形核(圖2)。再根據Ly6G的表達不同分選出單核系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G-)亞群(M亞群)和粒系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G+)亞群(G亞群)。采用流式細胞儀分選分離出模型小鼠骨髓MDSCs的兩個亞群，分別將其與CD4+T或CD8+T細胞共培養，發現G細胞亞群與M細胞亞群均可以抑制CD4+T或CD8+T淋巴細胞增殖，且抑制作用呈劑量依賴性，以G細胞亞群的抑制作用更強大，表明因感染因素刺激導致體內增加的骨髓MDSCs在體外也具有免疫抑制作用。

既往研究顯示，病理條件下MDSCs發揮免疫抑制作用的機制是其能夠分泌和產生大量TGF-β、誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)和ArgⅠ，以及通過細胞間相互作用促進T細胞凋亡和CD3ζ的表達，妨礙T細胞活化增殖等功能[10-12]。此外，MDSCs還可以分泌IFN-γ、IL-4、IL-13和IL-10等細胞因子，這些細胞因子可以調節機體Th1細胞向Th2分化從而輔助MDSCs營造抑制性環境，另外還可增加NOS2、ArgⅠ和血紅素氧化酶1(HO-1)的表達，從而消耗機體內環境的精氨酸并產生NO及其他代謝產物，最終抑制T細胞的功能[13-15]。為此本研究也檢測了血吸蟲感染模型小鼠體內的骨髓MDSCs的相關細胞因子IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ及TGF-β1的mRNA表達水平，同時檢測了NOS2和ArgⅠ的mRNA表達水平。Real-time PCR檢測結果顯示各個細胞因子及兩種酶均較對照組的正常小鼠有不同程度的升高，其差異有顯著性，表明上述因素參與了模型小鼠骨髓MDSCs的免疫抑制作用。

本研究通過構建日本血吸蟲感染小鼠模型，研究了MDSCs在寄生蟲感染領域中的作用。MDSCs是維持機體免疫平衡的因素之一，了解其亞群的分化和作用機制將有助于制定寄生蟲感染的防治策略。