五味子乙素對肝癌細胞凋亡、侵襲及血管新生的調節作用①

彭朝陽 賈廷印 李好朝 喬澤強

(南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院普通外科,南陽473058)

肝癌是全球第六大常見癌癥，占全球癌癥患者的5.6%，而且肝癌致死率高，肝癌致死人數占全球27種常見癌癥致死總數的9.1%，居第二位[1]。中國歷來就是肝癌高危地區，約一半的肝癌新增病例和死亡病例都發生在中國[2,3]。2015年中國新增肝癌病例46.6萬，肝癌死亡病例42.2萬[4]。肝癌給中國造成了嚴重的社會經濟負擔。開發有效的肝癌治療方法對中國衛生醫療系統具有重要意義。大量研究表明在肝癌的治療中傳統中藥的輔助性治療有助于提高肝癌患者存活[5]。北五味子作為傳統中藥已具有幾千年的歷史，常被用于治療胃腸道疾病，呼吸衰竭，心血管疾病及過度出汗和失眠等。五味子乙素(化學結構式見圖1 )是北五味子最主要的活性物質，屬于聯苯環辛烯類木脂素，可誘導癌細胞凋亡，抑制癌細胞轉移，有利于膽囊癌及神經膠質瘤等癌癥的治療[6,7]。但五味子乙素在肝癌中的研究還比較缺乏，有待進一步研究。本研究主要目的是探索五味子乙素對高轉移能力的肝癌細胞HCCLM3存活和運動能力及血管新生因子的調節作用。

圖1 五味子乙素化學結構式

1 材料與方法

1.1材料 高轉移能力的肝癌細胞系HCCLM3來源于美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。五味子乙素購自Sigma公司。培養基 DMEM和胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。MTT購自上海生工。細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit和Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司。抗Bcl 2相關蛋白X(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體、抗B細胞淋巴瘤(B cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體、抗基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloprotein2,MMP-2)抗體、抗MMP-9抗體、抗血管內皮細胞生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)抗體、抗表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)抗體和抗成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及藥物處理 HCCLM3細胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養基，并置于37℃，5% CO2的恒溫培養箱中培養。當細胞增殖到約80%時進行傳代。不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L) 五味子乙素處理HCCLM3后利用MTT檢測細胞存活率。后續實驗選擇5、10、20 μmol/L的五味子乙素進行處理，對照組用DMSO代替五味子乙素。

1.2.2MTT檢測細胞存活力 HCCLM3細胞制成1×104個/ml的細胞懸液接種到96孔板中，過夜培養后棄去培養液，加入含不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L)五味子乙素的培養液培養48 h。向孔板中加入MTT溶液孵育4 h后棄上清，加入DMSO振蕩10 min，溶解結晶物后570 nm處檢測吸光值。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 五味子乙素處理48 h后，將各組待測細胞用1×的Binding buffer制成1×106個/ml的細胞懸液。接著用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)對細胞進行染色15 min，然后利用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測。

1.2.4蛋白印跡 五味子乙素處理48 h后用PBS清洗待測細胞3次后，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min后等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜。5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育，第二天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量。

1.2.5Transwell檢測細胞侵襲 用含1%胎牛血清的DMEM培養液將各組細胞制成1×106個/ml的細胞懸液，加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培養液。37℃培養24 h后，用0.5%的結晶紫對上室底部細胞進行染色，用棉簽除去上室內側的細胞。顯微鏡下觀察并統計細胞數量。

1.3統計學分析 實驗數據用SPSS16.0軟件進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗，P<0.05認為差異存在明顯統計學意義。

2 結果

2.1五味子乙素對肝癌細胞HCCLM3存活力的影響 不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L)五味子乙素處理HCCLM3后利用MTT檢測細胞存活率，分析五味子乙素對肝癌細胞存活力的影響。圖2 顯示，當五味子乙素小于20 μmol/L時，HCCLM3細胞存活率沒有顯著變化，維持在80%以上。當五味子乙素大于20 μmol/L時HCCLM3細胞存活率急劇下降，降低到80%以下。上述結果表明，小于20 μmol/L的五味子乙素對HCCLM3細胞存活力無明顯影響，大于20 μmol/L的五味子乙素會降低HCCLM3細胞存活力。

2.2五味子乙素促進HCCLM3細胞凋亡 流式細胞術檢測五味子乙素(5、10、20 μmol/L)處理后HCCLM3細胞凋亡率，分析五味子乙素對肝癌細胞凋亡的影響。由圖3可知，5 μmol/L五味子乙素組細胞凋亡率與DMSO組無明顯變化，10和20 μmol/L五味子乙素組細胞凋亡率明顯高于DMSO組(P<0.05)。由此可見，五味子乙素具有誘導HCCLM3細胞凋亡的作用。

2.3五味子乙素對細胞凋亡標記蛋白表達的影響 通過蛋白印跡檢測五味子乙素對HCCLM3細胞凋亡標記蛋白表達的影響。如圖4所示，5 μmol/L五味子乙素組Bcl-2蛋白相對表達量明顯低于DMSO組(P<0.05)。與DMSO組相比，10和20 μmol/L五味子乙素組Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯下降(P<0.05)。以上結果說明，五味子乙素會增強HCCLM3細胞Bax表達，抑制Bcl-2表達。

2.4五味子乙素降低HCCLM3細胞侵襲 利用Transwell檢測五味子乙素(5、10、20 μmol/L)處理后HCCLM3細胞侵襲，探究五味子乙素對肝癌細胞侵襲的影響。由圖5可知，五味子乙素(5、10、20 μmol/L)組每個視野下侵襲細胞數目明顯少于DMSO組(P<0.05)。上述結果表明，五味子乙素可減弱HCCLM3細胞侵襲。

圖2 MTT檢測細胞活力

圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡

2.5五味子乙素抑制細胞侵襲標記蛋白表達 蛋白印跡檢測HCCLM3細胞MMP-2和MMP-9表達，分析五味子乙素對侵襲標記蛋白表達的影響。如圖6所示，五味子乙素(5、10、20 μmol/L)組MMP-2和MMP-9相對蛋白表達量明顯低于DMSO組(P<0.05)。以上結果說明，五味子乙素會降低HCCLM3細胞侵襲標記蛋白MMP-2和MMP-9表達。

2.6五味子乙素減弱血管新生因子表達 為分析五味子乙素對HCCLM3細胞血管新生因子表達的影響，蛋白印跡檢測VEGF-A,EGF和bFGF表達。圖7顯示，5 μmol/L五味子乙素組EGF和bFGF蛋白相對表達量明顯低于DMSO組(P<0.05)。與DMSO組相比，10和20 μmol/L五味子乙素組VEGF-A、EGF和bFGF蛋白相對表達量明顯下降(P<0.05)。由此可見，五味子乙素可抑制HCCLM3細胞血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表達。

圖4 蛋白印跡檢測細胞凋亡標記蛋白表達

圖5 Transwell檢測細胞侵襲

圖6 蛋白印跡檢測細胞侵襲標記蛋白表達

圖7 蛋白印跡檢測血管新生因子表達

3 討論

研究表明對不同階段的肝癌需選擇不同的治療方法，早期肝癌一般可以通過外科手術(部分肝切除或肝移植)進行治療，但肝癌一旦轉移外科手術就不再適用，目前對中期和晚期的肝癌主要依靠化療、放療、靶向治療、免疫治療及溶瘤病毒治療等[8]。但這些方法存在著副作用大及效果不理想等缺點。越來越多的研究表明許多天然植物產物在癌癥治療方面發揮著積極作用[9,10]。

大量文獻報道多種植物提取物具有抑制癌細胞活力及促進癌細胞凋亡的功效。有研究表明地耳草提取物可增強肝癌HepG2細胞Bax表達，減弱Bcl-2表達，促進細胞凋亡[11]。Lin等[12]發現來源于線狀花瞿麥的異紅草素可抑制肝癌HepG2細胞活力，提高Bax表達，降低Bcl-2表達，誘導細胞凋亡。有數據顯示來源于橘核的橘皮苷可增強肝癌HepG2細胞Bax表達，提高細胞凋亡[13]。據報道五味子乙素可減弱膽囊癌細胞活力，促進細胞凋亡，抑制Bcl-2表達，提高Bax表達[7]。有研究發現在膽管細胞型肝癌中五味子乙素可降低細胞活力，誘導細胞凋亡，減弱Bcl-2表達，增強Bax表達[14]。另外，五味子乙素還可減弱結腸直腸癌細胞活力，促進細胞凋亡[15]。本研究結果顯示，小于20 μmol/L的五味子乙素對HCCLM3細胞存活力無明顯影響，大于20 μmol/L的五味子乙素會降低HCCLM3細胞存活力。五味子乙素(10、20 μmol/L)會增強Bax表達，抑制Bcl-2表達，誘導細胞凋亡。

癌細胞侵襲能力在癌癥轉移過程中具有重要作用。許多植物提取物可抑制癌細胞侵襲。有數據顯示雪蓮提取物和來源于菩提樹的三萜類化合物都可以減弱肝癌細胞MMP-2和MMP-9表達，降低胞侵襲能力[16,17]。另外，蟻巢木葉子提取物會降低肝癌SK-Hep1和 Huh7細胞MMP-2和MMP-9活性，減弱細胞侵襲能力[18]。有研究表明獼猴桃根提取物具有降低肝癌HepG2和MHCC97H細胞MMP-2和MMP-9表達，抑制細胞侵襲的功效[19]。據報道在神經膠質瘤細胞中，五味子乙素可降低MMP-9表達，抑制細胞侵襲[6]。有研究發現五味子乙素還可抑制肺腺癌細胞MMP-2和MMP-9表達，減弱細胞侵襲能力[20]。本文結果表明，五味子乙素會降低HCCLM3細胞MMP-2和MMP-9表達，減弱細胞侵襲能力。

越來越多的研究表明多種天然植物產物具有抑制血管新生的功能[21]。有數據顯示黃花敗醬提取物可降低結腸直腸癌細胞VEGF-A表達[22]。Atmaca等[23]發現三裂鼠尾草提取物可減弱前列腺癌細胞EGF和bFGF表達。有研究表明黃連提取物可抑制肝癌MHCC97L和HepG2細胞VEGF表達[24]。據報道苦味葉下珠及珍珠草提取物具有降低黑色素瘤細胞HIF-α和VEFG表達的功效[25]。本研究結果顯示，五味子乙素可抑制HCCLM3細胞血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表達。

總體來說，在高轉移能力的肝癌HCCLM3細胞中，五味子乙素可通過Bax/Bcl-2介導的信號通路誘導細胞凋亡；并通過降低MMP-2和MMP-9表達減弱細胞侵襲；同時還可抑制血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表達。綜上訴述，五味子乙素可誘導肝癌細胞HCCLM3凋亡，降低細胞侵襲能力及血管新生因子表達。后續將進行體內研究，分析五味子乙素對肝癌腫瘤進程的影響，為挖掘新的肝癌治療方法提供理論依據。