火針對膝骨關節炎大鼠關節軟骨MMP-3、TGF-β1、TNF-α的影響①

劉艷偉 孟愛霞 胡 華 李連泰 杜志峰 王書君 徐 昆

(承德醫學院附屬醫院骨傷科，承德067000)

膝骨關節炎(Knee osteoarthritis,KOA)是最常見的關節退行性疾病，我國成年人中膝骨關節炎的患病率高達9.6%。隨著社會人口老齡化，本病的發生率也將越來越高[1]。由于關節軟骨損傷后很難修復，嚴重影響關節功能的恢復，導致治療周期長，給患者的生活帶來嚴重影響。因此，如何修復損傷的關節軟骨，恢復關節功能，成為臨床康復醫學棘手的問題。研究顯示，MMP-3、TGF-β1和TNF-α在關節軟骨損傷及修復過程中發揮著重要作用[2，3]。MMP-3是MMPs家族的主要成員之一，能分泌大量的細胞外分子，降解細胞外基質膜成分，參與膝骨關節炎病程發展的重要物質[4]。TNF-α是一種血管生成多肽因子，與軟骨組織的破壞關系密切。TGF-β1屬于轉化生長因子，膝骨關節炎患者常表現出高表達，同時也是病情加重的重要促進因素[5]。KOA的臨床治療主要是改善相關癥狀，非甾體抗炎藥是常用藥物，但長期服用常引起副作用，如胃腸道不適等。臨床研究表明：針灸在緩解患者膝關節炎引起的疼痛、腫脹等方面有顯著療效，但具體機制尚不明確[6，7]。火針臨床治療膝骨關節炎療效顯著，具有舒筋通絡、止痛、消腫的功效。本研究旨在探討火針對KOA大鼠關節軟骨MMP-3、TGF-β1、TNF-α的影響。

1 材料與方法

1.1材料 30只6周齡雄性SPF級SD大鼠,體質量(250±20)g,河北省醫科大學實驗動物中心提供,實驗動物許可證號：SCXK(冀)2014-001。實驗過程中對大鼠的處置嚴格遵守國家科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。轉化生長因子β1放免試劑盒、腫瘤壞死因子α放免試劑盒、基質金屬蛋白酶3放免試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)；石膏繃帶(浙江義烏諾醫療衛生用品有限公司)；火針(北京中國針灸研究所)。lympus光學顯微鏡(日本BHS)；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(Heal Force)；DV800型全自動生化測定儀(美國Bechman公司)。

1.2方法

1.2.1分組 將30只大鼠隨機分為正常組10只，模型組20只。參考文獻[2]方法，模型組采用后肢伸直位固定法造模。造模前12 h禁食，麻醉后剃去后肢髖關節至腳趾毛，踝關節背屈70～90度，伸展膝關節至160～180度，紗布固定，將石膏從腹股溝至腳趾纏繞大鼠后肢，腳趾露出，繃帶固定。每日2次觀察制動情況及其腳趾血流情況，6周后解除束縛，觀察大鼠行為學改變，后肢膝關節腫脹情況，對局部按壓的疼痛反應程度等各方面進行程度評分。將20只KOA模型大鼠隨機再分為模型組、火針組。正常組和模型組給予正常飲食，不作任何治療。火針組參照《實驗針灸學》，選取膝前穴、阿是穴和陽陵泉穴，在穴位上涂一層薄薄的萬花油，在酒精燈的外焰將賀氏火針燒至紅白，迅速點刺入1～2 mm，然后迅速拔出，干棉球按壓針孔片刻，每3 d行一次針，共治療6次。

1.2.2Lequesne MG評分 造模結束后及最后一次火針后的次日即對全部大鼠進行評分，觀察其后肢膝關節腫脹情況，局部按壓疼痛反應、步態、關節可自由活動的角度等方面由同一觀察者進行操作評分。

1.2.3標本采集 脫頸處死各組大鼠，收集腹主動脈血，固定大鼠，伸直關節，切開皮膚，取下整個膝關節，觀察軟骨平面狀況，0.9%生理鹽水沖洗，然后一份置于4%中性甲醛中，另一份液氮凍存后轉入-80℃冰箱保存，備用。

1.2.4血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α檢測 取出-80℃冰箱血清樣品，按照試劑盒操作步驟，采用全自動生化檢測儀酶聯免疫法測定各組大鼠血清中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平。

1.2.5大鼠膝關節軟骨組織HE染色觀察 大鼠膝關節軟骨組織置于4%甲醛溶液中固定24 h，70%、80%、90%和100%梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，二甲苯透化，脫蠟，蒸餾水沖洗，進行HE染色，利用倒置顯微鏡觀察膝關節軟骨病理組織形態結構。

1.2.6放射免疫檢測軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α 取-80℃冰箱保存的大鼠膝關節軟骨組織，稱重后加入9倍量0.9%生理鹽水，勻漿，4℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液，按照放免試劑盒操作步驟進行放射免疫檢測，測定各組大鼠膝關節軟骨中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平。

2 結果

2.1各組大鼠Lequesne MG評分 治療前，與正常組比較，模型組和火針組大鼠Lequesne MG評分差異有顯著統計學意義(P<0.05)；治療后，與模型組和治療前比較，火針組大鼠評分明顯較低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。表明火針治療可明顯有效緩解KOA大鼠癥狀，對膝骨關節炎大鼠的行為學狀態具有明顯的改善作用。

2.2各組大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表達水平 與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，火針組大鼠血清MMP-3、TGF-β1和TNF-α表達水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3各組大鼠膝關節軟骨組織HE染色形態 顯微鏡下顯示：正常組大鼠膝骨關節軟骨表面光滑，細胞排列有一定規則，潮線清晰可見；模型組大鼠膝骨關節軟骨表面粗糙，軟骨細胞肥大，表層細胞壞死，巢狀增生，潮線消失，呈現明顯退行性病變；火針組大鼠膝骨關節軟骨表面較光滑，細胞排列規則，表層細胞輕度增生，潮線較完整。見圖3。

GroupsnBefore treatmentAfter treatmentControl1000Model108.41±0.861)7.18±0.671)Heated needle108.38±0.911)3.52±0.542)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

GroupsnMMP-3TGF-β1TNF-αControl1019.98±1.2415.11±1.0221.75±0.67Model1040.01±2.731)31.78±2.551)66.86±1.001)Heated needle1026.45±2.912)20.01±1.922)25.82±0.532)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

2.4放射免疫檢測各組大鼠軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α 與正常組比較，模型組大鼠膝關節軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，火針組大鼠膝關節軟骨組織MMP-3、TGF-β1和TNF-α含量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。表明火針治療能通過降低過度表達的MMP-3、TGF-β1和TNF-α使其發揮對膝關節軟骨細胞的促修復作用。

3 討論

KOA是一種以軟骨進行性關節軟骨變性、破壞，伴隨骨質增生反應的退行性疾病，以膝關節疼、腫脹、活動障礙為主要臨床表現，是臨床最常見的關節疾病之一，近年來發病率呈逐年上升趨勢[8]。現代醫學認為，軟骨合成降解因子水平降低、促合成因子水平增高是引起KOA的重要原因，而炎癥因子水平紊亂是該病發展的重要推動因素[9]。KOA屬于傳統中醫學“骨痹”、“痹證”、“膝痹”等范疇，多因風寒之邪引起，患者常表現出下肢畏寒、得溫痛減等癥狀[10，11]。針刺是中醫治療的重要組成部分，是臨床治療膝骨關節炎的常用手段，具有疏通經絡氣血、消腫止痛之功，廣泛用于KOA的治療，臨床療效顯著。火針是針灸的一種，可溫經散寒、消腫止痛、通經活絡、巧腐生新，能夠有效改善KOA癥狀。陽陵泉穴為八會穴之筋會，為治療筋病的要穴，具有強健腰膝、壯筋補虛功能；膝前及阿是穴能疏通局部經氣、行氣活血祛瘀。林國華等[12]發現“膝前穴、阿是穴、陽陵泉穴”三穴行使火針能抑制小鼠KOA病變發展，明顯改善膝關節靈活性。但目前火針對膝骨關節炎的治療作用相關機制少見報道，本研究選取膝前穴、阿是穴和陽陵泉穴火針治療6次后發現KOA模型大鼠膝骨關節軟骨表面較光滑，細胞排列規則，表層細胞輕度增生，潮線較完整，表明火針可改善KOA大鼠膝關節軟骨細胞排列情況，進而改善軟骨表面光滑度，達到治療目的，為火針的臨床應用提供實驗依據。

圖1 各組大鼠膝骨關節軟骨組織HE染色(×100)

GroupsnMMP-3(μg/mg)TGF-β1(pg/mg)TNF-α(pg/mg)Control109.11±0.121.44±0.136.79±0.88Model1021.48±0.391)3.37±0.221)12.03±1.011)Heated needle1012.61±0.222)2.10±0.192)8.23±0.732)

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group,2)P<0.05.

MMP-3是MMPs家族的主要成員之一，在膝骨關節炎、心血管疾病等疾病過程中起到重要促進作用，MMP-3是直接作用于膝關節軟骨細胞外基質的蛋白分解酶，導致其細胞外基質蛋白質降解，加速軟骨代謝分解，加重膝關節軟骨組織進一步損傷[13]。TGF-β1屬于轉化生長因子，與骨性關節炎發生發展密切相關，同時也是病情加重的重要促進因素。TGF-β1具有多種生物學作用：①促進細胞外基質蛋白質降解；②趨化單核細胞和成纖維細胞；③促進成骨細胞和成纖維細胞生長[14]。TNF-α是一種血管生成多肽因子，一方面其對軟骨細胞有極強的分解破壞作用，另一方面還可抑制軟骨基質合成。研究顯示，TNF-α可誘導產生前列腺素E2，前列腺素E2不僅可以直接對軟骨下骨產生分解，而且可以誘導激活MMPs，對軟骨基質的纖維結構重建造成嚴重阻礙作用[15-17]。本研究結果顯示，KOA模型大鼠血清和軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α表達水平均顯著升高，表明造模引發大鼠膝關節局部無菌性炎癥，誘發TNF-α大量表達，激活基質金屬蛋白酶原，導致MMP-3、TGF-β1含量升高。經火針治療后，KOA大鼠膝關節軟骨中MMP-3、TGF-β1和TNF-α明顯低于模型組，表明火針干預治療可抑制破壞因子的表達。

綜上所述，本研究結果顯示火針治療可有效減輕大鼠膝關節軟骨損傷，降低血清及膝關節軟骨組織中MMP-3、TGF-β1和TNF-α水平，這可能是火針治療膝骨關節炎的一個作用機制。