血漿mir-142-5p與冠狀動脈粥樣硬化程度的關系及其作用機制的研究

徐瑞金 秦 苗 高俊杰 葛云潔

(青島市市立醫院干部保健一科，青島266071)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是目前發達國家首位致死性病因。我國隨著經濟的發展和人們生活方式的改變，冠心病的發病率和死亡率也逐年升高，已成為嚴重的社會公共衛生問題。micro RNA是近年來發現的一類內源性單鏈非編碼RNA，其通過調節靶基因的表達，廣泛參與機體細胞的分化、增殖、凋亡等生理病理過程。mir-142-5p作為mir-142家族的一員，最早發現其與系統性紅斑狼瘡、肺癌、胃黏膜相關淋巴組織瘤等多種疾病的發病相關[1-3]，近年來有研究報道，冠心病患者循環中mir-142-5p也明顯升高[4]，提示其可能和冠脈病變有著密切關系。前期我們通過miRanda靶基因預測軟件(www.microrna.org/microrna/home.do)預測mir-142-5p可能的靶基因為胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)基因。本文通過對冠心病患者血漿mir-142-5p濃度的測定，分析其與冠脈病變程度之間的關系，并進一步研究其對血管內皮細胞IGF-1R表達的影響，探討mir-142-5p對冠狀動脈粥樣硬化的影響及作用機制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 所有研究對象均為相互間無血緣關系的青島地區漢族居民，分為健康對照組(N)和冠心病組(CHD)。其中冠心病組42例，為2016年2月至2017年5月在青島市市立醫院心內科住院患者，所有患者均經冠狀動脈造影檢查，且至少有1只主要冠脈血管狹窄>50%；對照組45例，均為健康志愿者，排除心血管、肝、腎和代謝性疾病。所有參加本研究者均簽署知情同意書。健康對照組年齡(51.54±16.51歲)和冠心病組年齡(52.21±14.31歲)差別無統計學意義(t=0.15,P>0.05)；健康對照組性別(男25例，女20例)和冠心病組(男23例，女19例)差異無統計學意義(t=0.12,P>0.05)，提示兩組間具有可比性。本試驗符合1983年頒布的赫爾辛基宣言，獲青島市市立醫院倫理委員會批準。

1.1.2人血管內皮細胞培養 人血管內皮細胞的細胞株均購自美國ATCC公司。細胞復蘇后傳代至3～5代備用。

1.2方法

1.2.1冠心病組均進行冠脈造影檢查，采用Gensini評分系統進行評分[1]：狹窄程度≤25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計4分，76%～90%計8分，91%～99%計16分，100%計32分。根據不同冠狀動脈分支將以上得分乘以相應系數，左主干病變：得分×5；左前降支病變：近段×2.5，中段×1.5，遠段×1；左回旋支病變：近段×2.5，中段×1，遠段×1；右冠狀動脈病變：近、中、遠段均×1；其他分支病變：得分×0.5。各病變支數得分總和即為該患者的冠狀動脈狹窄嚴重程度評分。

1.2.2標本采集 所有入選者過夜禁食12 h，次晨空腹抽取4 ml外周靜脈血EDTA-Na抗凝，離心后分離血漿，應用美國MRC Gene公司TRI Reagent BD試劑盒，提取血漿總RNA，應用NanoVue超微量分光光度計檢測A260/A280吸收率為1.8～2.1的標本為合格樣本，置-80℃保存備用。

1.2.3實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測血漿中mir-142-5p 應用Quantscript RT cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN，中國)將血漿總RNA逆轉錄合成cDNA備用。每個樣品均取3個重復，選擇U6作為內參，應用miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒檢測血漿mir-142-5p和U6。mir-142-5p上游引物：5′-CGCGCGCATAAAGTAGAAAGCAC-3′，下游引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′。U6上游引物：5′-GCAAGGATGACACGCAAAT-3′，下游引物5′-ATGGAACGCTTCACGAAT-3′。實時熒光定量PCR總反應體系20 μl，包括2.5×Realmastermix 9 μl，cDNA模板2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，以滅菌雙蒸水補足至20 μl。PCR反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性20 s，60℃退火30 s，68℃延伸40 s，共循環40次。

1.2.4mir-142-5p對人血管內皮細胞IGF-1R表達及NO釋放的影響 人血管內皮細胞的細胞株購自美國ACTT公司，使用80%DMEM高糖培養基+20%胎牛血清傳代培養。為研究IGF-1R在內皮細胞模擬動脈粥樣硬化環境中表達情況，我們將細胞分為兩大組：對照組和轉染組。對照組分為正常對照組(C)和ox-LDL處理組(C+ox-LDL)兩個亞組，其中C+ox-LDL在試驗前應用50 mg/ml的ox-LDL刺激24 h；轉染組在試驗前均應用50 mg/ml的ox-LDL刺激24 h，并分為三個亞組：mir-142-5p minics(應用mir-142-5p minics進行轉染)、mir-142-5p inhibitor組(應用mir-142-5p小干擾RNA進行轉染)和CN組(應用陰性對照進行轉染),其中mir-142-5p minics、小干擾RNA和陰性對照均由上海吉瑪公司構建生產。轉染過程嚴格按照LipofectamineTM2000說明書進行。孵育48 h后，應用Western blot法(試劑盒由上海生工生物工程公司提供)檢測各組IGF-1R蛋白表達情況，采用EPSON掃描儀掃描膠片并用Photoshop 軟件測定灰度值。應用Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA，應用RT-PCR檢測IGF-1R mRNA的相對表達量：選擇β-actin作為內參， IGF-1R上游引物：5′-GGAGGCTGAATACCG-3′，下游引物：5′-AAAGACGAAGTTGGAGGCGCT-3′。β-actin上游引物：5′-TCCTCCCTGCTGCTCCGATTCCG-3′，下游引物5′-TGATCTCCTTCTGCATCCTG-3′。RT-PCR具體操作步驟及實驗條件同1.2.3。分離細胞培養上清液，通過測定上清液中NO3-的濃度間接反映NO的濃度(采用硝酸鹽還原酶法，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)。

2 結果

2.1血漿mir-142-5p測定 本實驗重復樣品擴增曲線重疊性好，溶解曲線呈單峰，提示引物設計合理，無非特異性擴增。取3個重復樣品的平均Ct值作為此樣品待測基因的Ct值，各組血漿mir-142-5p相對表達量以2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=Ctmir-142-5p-CtU6。經計算，健康組血漿mir-142-5p相對表達量為0.11±0.037，冠心病組mir-142-5p相對表達量為0.13±0.027(見圖1)，兩組比較差異有統計學意義(t=2.496，P<0.05)。

2.2冠心病組血漿mir-142-5p水平和Gensini評分相關性分析 冠心病組血漿mir-142-5p水平和Gensini評分采用二元變量相關分析，Pearson相關系數為0.499，P<0.01，提示兩者具有相關性(見圖2)。

2.3Western blot法檢測mir-142-5p對血管內皮細胞 IGF-1R蛋白水平的影響 各組IGF-1R的相對表達量以IGF-1R/β-actin表示(見圖3A、B)。

圖1 健康組和冠心病組血漿mir-142-5p水平

圖2 冠心病組血漿mir-142-5p水平和Gensini評分的相關性分析

C+ox-LDL組IGF-1R蛋白表達較C組升高(t=40.02，P<0.01)；mir-142-5p inhibitor組IGF-1R蛋白表達較C+ox-LDL組和CN組明顯升高(t=14.85、46.22，P均<0.01)，而mir-142-5p minics組IGF-1R蛋白表達明顯低于C+ox-LDL組和CN組(t=20.49、22.16，P均<0.01)；C+ox-LDL組和CN組的蛋白表達差異無統計學意義(t=0.13，P>0.05)。

2.4PT-PCR法檢測mir-142-5p對血管內皮細胞IGF-1R mRNA表達水平的影響 各組IGF-1R相對表達量以2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=CtIGF-1R-Ctβ-actin(見圖3C)。C+ox-LDL組IGF-1R mRNA的表達較C組升高(t=35.37，P<0.01)；mir-142-5p inhibitor組IGF-1R mRNA的表達較C+ox-LDL組和CN組明顯升高(t=17.63、40.32，P均<0.01)，而mir-142-5p minics組IGF-1R mRNA表達明顯低于C+ox-LDL組和CN組(t=19.65、21.93，P均<0.01)；C+ox-LDL組和CN組的mRNA表達差異無統計學意義(t=0.15，P>0.05)。

圖3 各組內皮細胞IGF-1R表達情況

圖4 各組內皮細胞NO合成情況

2.6各組內皮細胞NO合成情況 根據各組內皮細胞培養液NO濃度檢測結果(見圖4)，C+ox-LDL組培養液中NO水平的表達較C組升高(t=10.79，P<0.01)；mir-142-5p inhibitor組NO濃度較C+ox-LDL組和CN組明顯升高(t=6.87、8.61，P均<0.05)，而mir-142-5p minics組明顯低于C+ox-LDL組和CN組(t=7.19、6.95，P均<0.05)；C+ox-LDL組和CN組的NO濃度差異無統計學意義(t=0.69，P>0.05)。

3 討論

microRNAs是近年來發現的一類體內自然存在、內源性高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，大約由18～25個核苷酸構成。研究發現，microRNAs可以通過與信使RNA的3′UTR堿基互補配對而與目標信使RNA特異性結合，干擾或促進信使RNA的轉錄，進而調節靶蛋白的表達[5，6]。作為一種新型的基因調控因子，microRNAs廣泛參與到多種基本生物學過程，在生命活動中發揮了重要調控作用。在心血管系統疾病中，異常表達的microRNAs參與了包括血管平滑肌細胞增殖和遷移、內皮功能變化以及巨噬細胞功能變化和凋亡等病理過程[7-9]。microRNA性質穩定，在體內和體外環境中可穩定存在，可以作為心腦血管或其他疾病的標志物。本研究發現，冠心病患者血漿mir-142-5p水平明顯高于健康志愿者，提示mir-142-5p可能參與了冠狀動脈粥樣硬化的病變過程。值得注意的是，我們研究發現冠心病組血漿mir-142-5p升高程度和Gensini評分相關，提示血漿mir-142-5p升高程度可反應冠脈病變的程度。前期也有動物實驗[10]發現，mir-142-5p在小鼠動脈不穩定斑塊中的表達升高，推測其可能和動脈粥樣硬化斑塊的穩定性有關。因此在臨床工作中，血漿mir-142-5p水平可以作為一種新的標志物協助我們判斷冠狀動脈病變程度。

血管內皮細胞是循環血液和血管平滑肌之間的機械屏障，也是重要的內分泌器官。正常的血管內皮功能對維持內環境穩定、調節血液循環有著重要作用，血管內皮損傷是動脈粥樣硬化的始動因素[11]。胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor 1，IGF-1)是一種由70個氨基酸組成的多肽類激素，是肌體細胞生長、分化和凋亡的重要調節因子。IGF-1主要在肝臟內合成，通過和細胞表面的IGF-1R結合發揮其生物學作用。IGF-1R在肌體大多數組織中都有表達，血管內皮細胞表面也有IGF-1R的表達。近年來研究表明，IGF-1可以通過和內皮細胞IGF-1R高親和力的結合，提高內皮型NO合酶活性，促進NO釋放。NO可以通過擴張血管、清除氧自由基、抗炎、抗血小板聚集、促進鉀通道開放等作用，從而起到調節內皮功能、促進內皮修復、保護心血管的作用[12]。我們前期應用數據庫及預測軟件發現，IGF-1R基因可能為mir-142-5p的靶基因。我們應用ox-LDL刺激內皮細胞發現，內皮細胞IGF-1R蛋白和mRNA的表達量升高、NO的釋放增加，提示在高脂環境下內皮細胞IGF-1R的表達增高，這可能是內皮細胞針對高脂損傷的一種自我保護機制，損傷的內皮細胞通過過表達IGF-1R而釋放更多的NO，從而進行自我功能調節和修復。進一步研究發現，轉染mir-142-5p minics的內皮細胞的IGF-1R蛋白和mRNA表達量下降，而轉染mir-142-5p inhibitor的內皮細胞IGF-1R蛋白和mRNA表達量均升高，提示mir-142-5p可以抑制IGF-1R基因的表達，IGF-1R可能是mir-142-5p的靶基因之一。冠心病患者血漿mir-142-5p的升高可以通過抑制內皮細胞IGF-1R的表達而阻礙受損內皮細胞的修復和功能調節，從而促進動脈粥樣硬化的進展。

綜上所述，mir-142-5p通過靶定IGF-1R基因損傷血管內皮功能，并且其血漿濃度和冠脈病變程度呈正相關，提示mir-142-5p血漿濃度可以作為一種新的標志物來協助我們判斷冠脈病變程度。動脈粥樣硬化機制復雜，涉及血管內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞等多種細胞的共同作用，下一步我們將進一步研究mir-142-5p對其他各種與動脈粥樣硬化有關組織和細胞的影響，并繼續尋找其他可能的靶基因，探討和驗證mir-142-5p在動脈粥樣硬化中發揮的作用，為動脈粥樣硬化的預防和治療提供新的思路和治療靶點。