核酸適配體分子信標探針在腫瘤研究中的應用進展△

黃晨，李婉明

中國醫科大學衛生部細胞生物學重點實驗室/醫學細胞生物學教育部重點實驗室/細胞生物學教研室，沈陽110122

分子信標在1996年由Tyaqi和Kramer[1]首次報道，有特殊的發夾結構，是一種新型熒光探針，具有背景信號低、操作簡單、特異性識別強、靈敏度高，以及無需與未反應的探針分離即可實時檢測等特點，因此近年來被廣泛應用于生命科學研究的眾多領域[2]。隨著分子信標技術的發展和成熟，研究者已發展出多種新型分子信標，使分子信標的應用不再受限于核酸分子的雜交檢測[3]。核酸適配體是可以折疊成明確三維結構并通過空間構型互補與靶分子結合的一段短的單鏈寡核苷酸序列（ssDNA或RNA），于1990年被Ellington和Szostak[4]與 Tuerk和Gold[5]首次利用指數富集配體的系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得，因其具有靶分子廣泛、特異性及親和力強、穩定性好、變性復性快速可逆、易于化學修飾和標記等諸多優點，在生物醫學領域受到廣泛關注并顯示出良好的應用前景[6-7]。本文對基于核酸適配體的分子信標探針在腫瘤研究中的進展進行簡要綜述。

1 分子信標的結構和原理

分子信標是一種特殊設計的具有莖-環（loopstem）結構的寡核苷酸探針，其中環部是目標識別區，通常由25～35個堿基組成；莖部由5～8個堿基互補序列組成，熒光基團和淬滅基團分別共價的連接在莖部的兩個末端。當目標分子不存在時，兩側堿基配對形成雙螺旋，使分子信標呈發夾型結構，繼而使分別修飾在5'末端的熒光基團和3'末端的淬滅基團相互接近，二者之間發生能量轉移（直接能量轉移或者熒光共振能量轉移），熒光幾乎被淬滅。當目標存在時，分子信標的環部與目標結合，分子間強雜交作用力打開莖部螺旋，導致分子信標的構象改變，熒光基團和淬滅基團分離，二者之間的能量轉移終止，熒光基團恢復熒光，且熒光強度與目標濃度呈正比[8]。但是，因為分子信標是一段核苷酸序列，易被核酸酶分解且容易與單鏈DNA結合蛋白非特異性結合，限制了其在臨床生物學中的應用[9-10]。因此，設計生物穩定性和特異性高的分子信標，使其更好地應用于臨床，具有重要的意義。

2 核酸適配體的結構和原理

核酸適配體是通過SELEX從隨機寡核苷酸庫中篩選出來的，能與靶點特異性結合的寡核苷酸（DNA或RNA）序列。核酸適配體的靶點類型非常廣泛，包括酶、核苷酸、抗體、轉錄因子、生長因子、多肽、氨基酸、抗生素、有機染料及重金屬離子，甚至完整的病毒和病原體以及完整的細胞[11]。核酸適配體本質上是由一段單鏈核酸分子折疊成的特殊三維結構，如發夾（hairpin）、內環（internal loops）、假結（pseudoknot）、凸環（bulge）、G-四聚體（G-tetramer）等，與靶點高親和力、高特異性結合[12]，被稱為“化學抗體”。與蛋白抗體相比，核酸適配體具有親和力及特異性高、合成簡單、相對分子質量低、化學結構穩定性高、不良反應少、免疫原性低和便于修飾多種功能基團或材料等優點[13-14]。利用核酸適配體的分子識別特性，可設計多種針對不同類型靶點的核酸適配體分子探針，極大地擴展了核酸探針在生命科學研究領域的應用范圍。

3 核酸適配體分子信標探針的設計

核酸適配體分子信標是將核酸適配體和分子信標結合起來的一種新型分子信標，其在分子信標的基礎上，對核酸適配體進行合適的剪切、延長和合并，使核酸適配體融合到分子信標中，從而完成高效熒光探針的設計，它的出現極大地擴展了檢測目標的范圍并提高了檢測的靈敏度[15-16]。核酸適配體分子信標的莖、環部分是由某種待檢測物的核酸適配體構成。核酸適配體在分子信標的設計中作為識別單元，結構靈活，與靶點作用后其結構可發生改變或重構，是實現信號轉導的理想選擇[17]。這類分子信標的優點首先在于只要篩選出目標物的核酸適配體，就可以設計出相應的分子信標并對其進行檢測；其次，核酸適配體的靶點類型廣泛，以其為基礎設計的分子信標的應用范圍也廣泛，在各領域都具有良好的應用前景；最后，核酸適配體對靶點具有高親和力與高特異性，因此可以明顯提高被檢測靶點的靈敏度和選擇性。Hamaguchi等[18]通過延長核酸適配體的一端使其自雜交形成發夾結構，構建了一種靶向凝血酶的檢測下限可達10 nmol/L的核酸適配體分子信標探針。Yamamoto等[19]發展了一種“拆分型”的核酸適配體分子信標探針，當目標蛋白的濃度為200 nmol/L時，熒光強度增強約14倍，可實現對目標蛋白的高靈敏檢測。

4 核酸適配體分子信標探針在腫瘤中的應用

近年來，SELEX篩選技術不斷發展和完善，逐步篩選出越來越多的核酸適配體，核酸適配體分子信標探針為生物成像領域，尤其是腫瘤領域的發展提供了大量性能優異的分子研究工具。

4.1 體內核酸的分析和檢測

細胞內特定mRNA的表達水平和亞細胞分布可以很好地反映生物體內的遺傳程序和應激反應，對細胞內mRNA的監測和檢測可為生物學研究、醫學診斷及治療、藥物開發等提供有價值的信息[20]。經典的分子信標是一種性能優異的核酸分子檢測工具，但是分子信標本質上也是核酸，作為一種帶負電荷的親水性生物大分子，難以跨越同樣帶負電荷的細胞膜，很大程度上限制了其在生物體內的應用[21]。某些功能性核酸適配體具有細胞特異性內化功能，可作為靶向腫瘤細胞的輸送載體，以其為基礎設計的分子信標探針，可實現活細胞的靶向穿膜[22]。Qiu等[23]將靶向核仁素的核酸適配體SA1411作為靶向輸送內化載體，成功地將分子信標高效地輸送到乳腺癌MCF-7細胞的細胞質中，并利用光照調控，既控制了分子信標的細胞內化功能，又實現了細胞質內靶點mRNA的高時空監測和追蹤。Ying等[24]設計了一種新型Light-up RNA適配體傳感器，成功用于活體內腫瘤細胞微小RNA（microRNA）的定量檢測，實現了體內腫瘤細胞的可視化和高靈敏檢測，這為其在腫瘤細胞中功能的闡明提供了可能性。

4.2 蛋白質的檢測

核酸適配體具有與靶點結合力強、特異性高、可體外合成、易功能修飾等諸多優點，在一定程度上彌補了抗體技術的不足。目前，運用SELEX已篩選出多種靶向蛋白質的核酸適配體，大部分為腫瘤相關標志物，并被廣泛應用于基礎研究和臨床診療[25]。利用核酸適配體的特性，無需分離洗脫樣品就可以快速、實時測定組分中的靶蛋白，這使其在腫瘤的早期診斷、臨床用藥等方面具有更重要的應用價值。血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）是一種具有誘導腫瘤新生血管形成以及直接或間接地促進腫瘤細胞的增殖和遷移的促血管生長因子。Yang等[26]設計了芘標記的核酸適配體分子信標探針，并對PDGF進行檢測，此探針在細胞培養基中對PDGF的檢測極限可達10-12mol/L級，可有效減少復雜基質中背景信號的干擾。Zhao等[27]也設計了一種靶向PDGF的核酸適配體分子信標探針，當探針結合PDGF時，核酸適配體發生構象改變，因其熒光基團相互靠近，發生熒光共振能量轉移，產生熒光信號。將探針固定在間充質干細胞的細胞膜表面，實現了對外加的或相鄰細胞分泌的PDGF高時空分辨的定量檢測，并可在單細胞水平上對細胞遷移進行實時監測。

4.3 腫瘤細胞的成像

以完整活細胞為靶點的cell-SELEX篩選出的核酸適配體可直接用于靶細胞的識別，這為腫瘤的診斷和治療提供了頗有潛力的分子識別成像探針[28]。Shi等[29]設計了一種可激活的核酸適配體分子信標探針（activatable aptamer probe，APP），用于靶向活體內腫瘤細胞的可視化檢測。APP處于靜止狀態時，所帶熒光基團被淬滅；當其結合靶點腫瘤細胞時，APP構象發生改變，熒光基團被釋放，熒光被恢復。以核酸適配體sgc8為基礎設計的APP，在200μl的樣品中實現了118例人急性淋巴白血病細胞（CCRF-CEM細胞）的檢出下限，有效地提高了腫瘤細胞檢測的靈敏度，為提高腫瘤早期診斷的準確性提供了新方法；APP成功用于活體成像，有效減少了非靶組織部位的背景信號，并縮短診斷時間至15 min，顯示出良好的靶細胞組織特異性。

及時進行腫瘤的診斷和腫瘤進展的監測具有重要的臨床意義，尤其是對循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的監測分析。Hwang等[30]設計了一種基于量子點（quantum dot，QD）同時靶向上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和黏蛋白 1（mucin1，muc1）（QD-EpCAM/muc1）的核酸適配體分子信標探針，用于CTC的檢測分析。在EpCAM/muc1不存在的情況下，該分子信標形成部分雙環狀結構并保持淬滅狀態；在EpCAM/muc1與各核酸適配體結合時，觸發分子信標構象改變，并釋放綠/紅熒光信號。QD-Ep-CAM/muc1核酸適配體分子信標探針成功地用于體外和體內EpCAM/muc1的監測和成像，為CTC的診斷提供選擇性和特異性更高的分子工具。

5 小結與展望

核酸適配體作為“化學抗體”，具有獨特的優勢，其作為熒光分子探針在生化分析和生物成像領域有著廣闊的應用前景，但其應用研究仍處于初級階段，還有許多問題需要解決：①核酸適配體的篩選方法比較繁瑣、耗時，目前被篩選出的核酸適配體數量非常有限，在一定程度上制約了核酸適配體的應用，急需開發更有效的篩選方法；②核酸適配體與靶點的結合信號模式，在一定程度上限制了檢測的靈敏度；③體內的復雜環境體系以及核酸適配體容易被核酸酶降解等因素極大地限制了核酸適配體分子信標在體內的應用。目前核酸適配體分子信標的應用大部分仍然停留于基礎研究階段，且主要集中于常用的核酸適配體的研究，實際應用遠不及蛋白抗體的普及。因此，如何克服以上局限性，進一步拓展核酸適配體分子信標在生命科學領域，特別是腫瘤領域的應用，需要科學工作者不斷努力和突破。相信隨著核酸適配體的發展，越來越多與不同靶點特異性結合的核酸適配體將被篩選出來，基于核酸適配體的分子信標將在生命科學領域得到進一步的發展。