嵌合抗原受體T細胞在腫瘤免疫治療中的研究進展

譚灝，李祥，康永，劉聰，楊偉晗

山西省中醫藥研究院方劑實驗室，太原 030012 00

近年來，盡管放療、化療及手術治療等常規腫瘤治療方法可以起到一定的治療效果，但腫瘤的轉移、復發及患者生存率低等問題仍未得到妥善解決[1]。隨著臨床研究的深入開展，嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor transduced T，CAR-T）細胞療法成為近年來腫瘤免疫治療的新方法并逐漸成為解決上述難題的重要方法[2-3]。CAR-T細胞免疫治療新策略給腫瘤患者帶來新的希望[4]，但仍有不足之處。

常規抗腫瘤治療的靶點位于腫瘤組織及細胞，但腫瘤免疫治療的重點在于提高患者自身免疫力。CAR-T細胞作為個體化的“活藥物”，結合T細胞殺傷作用和抗原抗體高親和性，經基因轉導使T淋巴細胞表達嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）后，在機體內識別腫瘤抗原，進而起到精確殺傷腫瘤細胞的作用。CAR-T細胞療法在卵巢癌、淋巴瘤及白血病等[5-6]惡性腫瘤治療中可以高效、準確地定位腫瘤靶點，療效可靠。與單克隆抗體相比，CAR-T細胞具有更有效且持久的抗腫瘤效果。

1 CAR的主要結構

CAR結構包含3個部分，依次為細胞外抗原結合區、細胞內信號肽區及跨膜區。細胞外抗原結合區的主要作用是對靶細胞外表的特異性抗原進行特異性識別，并起著決定性作用。CD3、CD4及CD28等構成了CAR跨膜區。該區域包括單鏈可變片段和鉸鏈區，其中單鏈可變片段是克服主要組織相容性復合體限制的關鍵，鉸鏈區促進腫瘤相關抗原的選擇。細胞內信號肽區的主要功能為信號轉導。目前CAR的信號域大致分為3代，已經從第1代單信號分子發展到含有CD28、4-1BB和其他共刺激分子的多信號域（第2、3代），并被廣泛應用于臨床[7]。

2 CAR-T細胞的作用機制

1989年Gross等首次提出了建立CAR，將抗原抗體的高親和性與T細胞的殺傷作用相結合，構建特異性CAR。通過一定途徑將編碼CAR的基因插入T細胞，使T細胞表達該抗體[8]。經一系列免疫反應修飾T細胞，再通過體外擴增及純化后重新輸入機體內。組建的CAR-T細胞不僅可以特異性識別腫瘤抗原，還可以與其有效結合，進而發揮更強的殺傷作用。在基因修飾的作用下，T細胞可以起到靶向殺傷的作用。腫瘤局部免疫微循環不僅不會對其進行抑制，還可以影響宿主免疫耐受，最終對腫瘤細胞起到特異性殺傷效果[9]。CAR-T細胞有3代，盡管第1代可以對腫瘤細胞進行識別，但僅表現為誘導細胞活化[10]，且其分泌的細胞因子水平過低，無法取得持久的抗腫瘤效應和T細胞增殖作用。為了使T細胞獲得更好的活化效果，第2代CAR-T細胞重組了共刺激分子，將CD28、CD137等置入CAR-T細胞中。一方面明顯增強了腫瘤相關抗原的活性；另一方面加速了白細胞介素-2的分泌，增強了T細胞的活化及增殖，起到殺傷腫瘤細胞的效果。在第3代CAR-T細胞中，CAR細胞內信號肽區多加入了兩個共刺激分子。與第2代對比，體外實驗結果顯示其抗腫瘤效應更強。盡管第3代CAR增強磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）信號通路活性[11]，上調抗凋亡蛋白表達，強化T細胞活化、增殖，但共刺激分子較強時會導致細胞因子風暴以及信號泄露。除此之外，其還會下調信號轉導閾值，造成未獲得抗原刺激下激活T細胞，最終殺傷鄰近正常組織細胞。目前，CAR技術已發展到第4代，在血液腫瘤和實體腫瘤治療中取得了一定的效果。

3 CAR-T細胞在臨床治療中的應用

常規腫瘤治療方法如手術治療、化療等的不良反應給患者身心帶來沉重的負擔。而CAR-T細胞療法不會明顯損傷正常細胞，僅對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用，不良反應極少，因此可以提高患者的治療依從性；同時CAR-T細胞還可以重建，增強患者的免疫功能，在抗腫瘤過程中發揮長效機制[12]。

CAR-T細胞可經單鏈抗體片段（single chain antibody fragment，scFv）可變區序列對腫瘤特異性抗原進行識別，再通過信號轉導分泌顆粒酶、穿孔素等，同時表達腫瘤壞死因子及Fas配體（Fas ligand，FasL）蛋白相關的凋亡配體，促使腫瘤細胞逐漸凋亡。另外，CAR-T細胞需要冷凍保存，冷凍可減少細胞因子如干擾素γ、白細胞介素-2及腫瘤壞死因子α等的分泌，具有抗腫瘤的作用[4]。很多血液腫瘤均具備特異性抗原及單克隆抗體，可以為CAR-T細胞的構建提供有效的scFv可變區以及靶點。因此，在血液腫瘤治療時CAR-T細胞應用廣泛，如CD19、CD133[13]。

3.1 CAR-T細胞在B細胞惡性腫瘤中的應用

經CAR修飾的自體或異體來源的T細胞靶向B細胞惡性腫瘤抗原CD19的研究，構建了CAR-T-19慢病毒表達載體，培養CAR-T-19細胞擴增體系。先通過體外殺傷實驗，后對9例患者進行臨床研究，得出CAR-T-19細胞治療難治、復發性小兒急性淋巴細胞白血病可獲得有效的疾病緩解[14-15]，B細胞非霍奇金淋巴瘤是一種非常罕見的惡性腫瘤，以抗CD20為基礎的化學免疫療法的標準治療對該病的控制非常有效。然而，標準療法對雙重打擊淋巴瘤、轉化型淋巴瘤或早期復發風險高的患者效果較差。過繼性CAR-T細胞治療是一項可以有效治療預后不良的B細胞淋巴瘤患者的新技術[16]。在B細胞非霍奇金淋巴瘤治療中靶向CD19的CAR-T細胞重定向免疫療法成為一種新的選擇，特別在難治、復發性非霍奇金淋巴瘤的Ⅰ期臨床試驗中取得較好的效果[17]。除治療外，臨床護理也至關重要。通過分析13例接受CAR-T細胞免疫療法的B淋巴細胞血液惡性腫瘤患者的治療效果，得出充分的治療準備、積極的護理配合和并發癥的處理是促進患者康復的關鍵[18]。采用Meta分析法檢測CAR-T-19細胞治療B細胞惡性血液疾病的臨床療效，得出靶向CD19的CAR-T細胞治療B細胞惡性血液疾病的臨床療效顯著[19-20]。

3.2 CAR-T細胞在白血病中的應用

在急性髓細胞樣白血病（acute myeloid leukemia，AML）治療中發現化療耐藥和復發仍然是患者死亡的重要原因。由于化療藥物通常誘導機體發生嚴重的組織急性壞死或長期不良反應，進一步強化常規細胞毒性藥物化療可能行不通。因此，腫瘤抗原重定向CAR-T細胞免疫治療在復發或難治性B淋巴細胞白血病患者中發揮積極作用，成為AML患者的新精確藥物治療方法，可能提高白血病患者的緩解率并減少不良反應。治療過程中選擇最佳靶抗原，考慮不良反應緩解策略，以及規避潛在的CAR-T細胞耐藥性，對高風險AML患者的細胞免疫治療至關重要[21]。

CD19陽性的急性淋巴細胞白血病的有效治療方法首選CAR-T細胞療法。CAR-T細胞療法不僅可以降低耐藥患者體內腫瘤負荷，還可以提高疾病緩解率[22]，在血液惡性腫瘤治療中具有良好的應用前景[23-24]。另外，使用氟達拉濱（fludarabine，FDR）及馬磷酰胺（mafosfamide，MFA）改變細胞膜結構的方法可以誘導CAR-T-19細胞早期凋亡，這一機制奠定了化療藥物抑制CAR-T-19細胞作用的理論基礎[25]。

3.3 CAR-T細胞在其他腫瘤中的應用

CAR-T細胞作為個體化的“活藥物”，在白血病和淋巴瘤治療中抗腫瘤效果顯著[5]。除此之外，結合過繼性免疫治療的優勢，有學者提出卵巢癌臨床治療的新方法和新策略。通過對人外周血單核細胞的感染，制備穩定表達的CAR-T細胞，使用免疫組織化學法和蛋白質印跡法檢測卵巢癌樣本及細胞系中間皮素（mesothelin，MSLN）表達及CAR-T細胞對MSLN陽性卵巢癌細胞的殺傷能力。抗MSLN CAR-T細胞可以特異、有效、安全地殺滅卵巢癌細胞，抑制腫瘤生長[26]。

盡管實體瘤治療中CAR-T細胞療法尚未納入臨床試驗，但在動物模型實驗中獲得令人滿意的抗腫瘤效果，如Wing等[27]將溶瘤病毒與過繼性CAR-T細胞結合，提高了小鼠腫瘤模型的抗腫瘤效果，延長了其存活率，克服了CAR-T細胞作為實體瘤中單一療法的關鍵限制。在通過異種膠質瘤裸鼠移植瘤模型檢測靶向表皮生長因子受體Ⅲ型突變體（epidermal growth factor receptor typeⅢ variant，EGFRvⅢ）的CAR-T細胞對腫瘤的殺傷活性的研究中，體內腫瘤生長實驗顯示，靶向EGFRvⅢ的CAR-T細胞組腫瘤體積在注射后3周與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）陽性T細胞組比較，差異有統計學意義（P﹤0.01）[28]。在CAR-T細胞中，自然殺傷受體2D可以促進諸多細胞因子的分泌，進而使卵巢癌細胞被溶解[29]。除此之外，在肺癌、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及肝癌中，CAR-T細胞亦起到一定的抗腫瘤效果。

自首次報道CAR-T細胞起，它主要用于治療肝硬化所致的腹腔積液。此外，CAR-T細胞也可以安全地應用于惡性腫瘤所致的腹腔積液。雖然尚無相關的證據，但CAR-T細胞可以作為一種治療頑固性腹腔積液的預期策略[30]。Kawada等[31]對1例確診胃癌[M，3型，cT4a（SE），cN0，cH0，cP1，cM1，C期Ⅳ]的患者進行CAR-T姑息治療，隨后是FLAST方案（5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸聯合紫杉醇）化療。經8個療程治療，無并發癥發生，癥狀改善。患者最終生存時間約18個月，并可長期攝取正常飲食。

4 關于CAR-T細胞安全性的分析

4.1 細胞因子風暴

隨著不斷積累臨床應用強效免疫治療劑的經驗，人們逐漸意識到其內在固有和潛在致命的不良反應，最嚴重的是細胞因子釋放綜合征（cytokine-release syndrome，CRS）[32]。CAR-T 細胞大量輸注后，通過抗原的刺激，能夠分泌大量的細胞因子，導致細胞因子風暴[33]，進而引起多器官功能衰竭與急性呼吸窘迫綜合征。由此可見，多次且小劑量地輸注CAR-T細胞具有重要意義，明確最安全且有效的CAR-T細胞的劑量可作為臨床工作的重點。

4.2 免疫排斥反應

目前CAR-T細胞使用的scFv基本來源于鼠源性單克隆抗體。人源化單克隆抗體的制備可通過基因工程進行，并且其于CAR-T細胞外區整合可以減少不良反應。因此，人源化單克隆抗體的引入將使CAR-T細胞的應用范圍再次擴大。

4.3 脫靶效應

CAR定向的靶抗原在正常組織中有不同程度的表達，因此CAR-T細胞與此類抗原結合會攻擊正常組織[34]，造成免疫缺陷或者組織損傷。因此，建立CAR-T細胞識別靶抗原，可以使腫瘤靶向性得到提高，進而避免正常組織的損傷。

4.4 CAR-T細胞歸宿

如果CAR-T細胞長期存在于體外而無法被清除，則會影響機體正常免疫應答反應。于CAR-T細胞中整合caspase 9自殺基因，對其激活并進行調控，可以有效清除CAR-T細胞。但是也有如單純皰疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）會自身激活，造成CAR-T細胞的消耗并影響其殺傷腫瘤細胞的效果[24]。Fas分子和DR5通路是通過結合Fas-Fc和DR5-Fc重組蛋白阻斷體內的CAR-T細胞起主導細胞凋亡的作用[35]。

5 小結

目前CAR-T細胞在治療某些血液腫瘤時可以起到一定的效果，但在實體瘤治療方面還有待提升。隨著臨床經驗的積累及CAR-T細胞結構的逐漸優化，CAR-T細胞治療的安全性可能獲得有效解決，其有望成為高效、安全的腫瘤治療方法，未來有望與化療及放療有效結合，使患者的預后得到最大程度的改善。