Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)研究進(jìn)展

陳高峰，王亞楠，王 丹，毛志慧，黃芝瑛，文海若，*，王 雪，*

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心，藥物非臨床安全性研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

體內(nèi)試驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地模擬藥物在機(jī)體吸收、分布、代謝、排泄并產(chǎn)生毒性作用的全過(guò)程，是藥物臨床前研究用以評(píng)價(jià)潛在遺傳毒性的重要手段。2011年修訂的人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH)遺傳毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則S2(R1)[1]在原有的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合基礎(chǔ)上增加了第2種選擇，即提供了不進(jìn)行體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)而直接開展體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)的可能，同時(shí)，建議在可行的條件下將多個(gè)終點(diǎn)的遺傳毒性研究整合至一般毒性研究中，以符合動(dòng)物試驗(yàn)“3R”原則。這無(wú)疑是對(duì)體內(nèi)遺傳毒性檢測(cè)方法提出了更高的要求，而目前被采納的體內(nèi)試驗(yàn)方法主要檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)變化和DNA損傷。因此，亟需開發(fā)快速、簡(jiǎn)便和實(shí)用的體內(nèi)基因突變?cè)囼?yàn)方法，以滿足受試物遺傳毒性評(píng)價(jià)的需求。近年建立的Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)作為新的體內(nèi)遺傳毒性檢測(cè)方法得到了快速發(fā)展，該方法快速簡(jiǎn)便，使用普通動(dòng)物即可開展試驗(yàn)，因此具有良好的實(shí)用性。

1 Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)原理

人的磷脂酰肌醇聚糖A類基因(phosphatidylinositol glycan class A gene)，簡(jiǎn)稱PIG-A基因(嚙齒類動(dòng)物同源基因?yàn)镻ig-a基因)，于1999年被Iida等[2]從人類基因組中成功分離。PIG-A基因位于X染色體上，在人和不同動(dòng)物物種間具有高度保守性。該基因的單一突變即可導(dǎo)致糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol，GPI)錨無(wú)法正常合成，GPI的一端為磷脂結(jié)構(gòu)，其脂肪酸鏈位于細(xì)胞膜內(nèi)，起連接固定作用；另一端為異質(zhì)性短分支多糖，延伸至細(xì)胞間隙，連接不同類型蛋白質(zhì)后構(gòu)成細(xì)胞表型[36]。許多細(xì)胞表面分化抗原，如CD48、CD55以及CD59等，正是通過(guò)GPI錨連接在細(xì)胞膜表面形成不同細(xì)胞表型而發(fā)揮生物效應(yīng)，所以當(dāng)GPI錨無(wú)法正常合成時(shí)，造成細(xì)胞GPI錨鏈蛋白缺失。PIG-A基因突變的大多數(shù)研究源于一種稱為人陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)的臨床疾病，PNH為罕見的由相當(dāng)大部分骨髓干細(xì)胞PIG-A基因突變所導(dǎo)致的獲得性遺傳損傷疾病[3]。由于骨髓干細(xì)胞為整個(gè)造血系統(tǒng)的先導(dǎo)，PIG-A基因突變會(huì)影響著許多細(xì)胞系的功能，包括紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等。PIG-A基因的突變間接地導(dǎo)致這些細(xì)胞表面GPI錨鏈蛋白的缺失，而一些GPI錨鏈蛋白已得到廣泛的研究，特別是CD55和CD59。

據(jù)Kawagoe等[4]報(bào)道，Pig-a基因的結(jié)構(gòu)、位點(diǎn)和功能在不同動(dòng)物種屬中均具有高度保守性，這也為在不同物種間建立體內(nèi)Pig-a突變檢測(cè)方法提供了可能。Pig-a基因在小鼠中，與人的同源性為88%，在核心區(qū)域的同源性為94.5%。Pig-a基因編碼N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的催化亞基，參與GPI錨的早期生物合成。在合成GPI的整個(gè)過(guò)程中所涉及的基因包括Pig-a基因在內(nèi)至少有12個(gè)。然而，只有Pig-a基因位于X染色體上，其他基因(如Pig-b和Pig-c等)均位于常染色體上[5]。由于在常染色體上兩個(gè)等位基因同時(shí)發(fā)生突變而導(dǎo)致GPI錨缺陷的事件非常罕見，而位于X染色體上Pig-a基因的單一突變即可使GPI錨無(wú)法表達(dá)，因此，GPI錨缺陷表型等同Pig-a基因突變，從而可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面GPI錨鏈蛋白來(lái)得知Pig-a基因突變的情況。該試驗(yàn)方法具有較長(zhǎng)的檢測(cè)窗，允許在試驗(yàn)過(guò)程中重復(fù)采集樣本，能夠無(wú)創(chuàng)、持續(xù)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的突變反應(yīng)，因而可較容易地整合至重復(fù)給藥毒性研究中，是極具發(fā)展前景的體內(nèi)基因突變檢測(cè)方法。因此，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面GPI錨鏈蛋白的缺失情況，以Pig-a基因突變率的變化來(lái)評(píng)價(jià)受試物的遺傳毒性。

2 Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)的建立

1999年，Araten等[6]建議建立以Pig-a基因?yàn)閳?bào)告基因的體內(nèi)基因突變?cè)囼?yàn)方法；2008年，Bryce和Miura等[7-9]首次正式報(bào)道以此試驗(yàn)方法開展臨床前遺傳毒性研究，試驗(yàn)以SD大鼠為受試對(duì)象，每隔1 d腹腔注射N-乙基-N-亞硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)或灌胃給予7,12-二甲基苯并[a]蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)3次，以外周血紅細(xì)胞表面CD59的缺失率作為Pig-a基因突變的檢測(cè)終點(diǎn)，以噻唑橙作為核酸染料區(qū)分正染紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀分析這兩種細(xì)胞群中突變細(xì)胞的比例，正式展開Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)在藥物安全評(píng)價(jià)領(lǐng)域的研究。由于GPI錨在不同物種間的生物合成高度保守，而且其合成起源于骨髓干細(xì)胞，在各類組織細(xì)胞及各系成熟紅細(xì)胞中均有表達(dá)。因此，Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)可在不同動(dòng)物種屬和不同類型組織中開展。目前，已初步在大鼠、小鼠、猴等動(dòng)物種屬中開展了該試驗(yàn)方法的研究，研究的組織或細(xì)胞類型包括外周血紅細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等[10-11]。研究表明，在不同動(dòng)物物種和不同組織細(xì)胞中均可檢測(cè)出Pig-a基因突變，而且誘發(fā)突變比自發(fā)突變有一定程度升高，由相同致突變物誘發(fā)的突變結(jié)果在不同物種間具有一致性。

3 體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)

3.1 Pig-a基因突變檢測(cè)方法分類

3.1.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法最初源于對(duì)PNH的診斷方法。致突變物使Pig-a基因發(fā)生突變可導(dǎo)致細(xì)胞GPI合成障礙，致使細(xì)胞表面GPI錨鏈蛋白缺失，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型，即可得到Pig-a基因的突變情況。此方法的具體操作是利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞表面至少一種GPI錨鏈蛋白(如CD59)以區(qū)分突變細(xì)胞與正常細(xì)胞，以及使用另外一種熒光標(biāo)記抗體和(或)流式設(shè)門策略將不同細(xì)胞群區(qū)分，從而檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞群中突變細(xì)胞的數(shù)量。例如，使用白細(xì)胞特異性抗體和散射光將外周血白細(xì)胞和血小板與目標(biāo)細(xì)胞(紅細(xì)胞)區(qū)分[8]；又如使用核酸染料區(qū)分正染紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞[7]；此外還可以使用梯度離心法初步將血樣中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板分離，富集紅細(xì)胞后再使用相應(yīng)的抗體標(biāo)記[12-13]。

GPI錨的合成起源于骨髓干細(xì)胞，其在多功能干細(xì)胞及各系成熟紅細(xì)胞中均有表達(dá)。基于流式細(xì)胞術(shù)的Pig-a基因突變檢測(cè)方法主要以外周血紅細(xì)胞或白細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞為樣品來(lái)源，而較少使用實(shí)體組織的單一細(xì)胞作為檢測(cè)樣品，其主要原因是處理實(shí)體組織時(shí)很難獲得細(xì)胞膜完整且數(shù)量足夠的單一細(xì)胞。從實(shí)體組織中獲得某單一細(xì)胞通常需要對(duì)組織進(jìn)行消化處理，而這種處理方式可能會(huì)破壞用于評(píng)估Pig-a基因突變情況的GPI錨及其錨鏈蛋白，從而人為地提高了樣品中突變細(xì)胞的比例。此外，一些特定類型的實(shí)質(zhì)細(xì)胞(如上皮細(xì)胞)表面具有自身熒光性質(zhì)，這可能會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，且不利于該試驗(yàn)方法的開發(fā)[10]。

目前，已用于Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)研究的單一細(xì)胞有大鼠紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞、小鼠紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞、大鼠T淋巴細(xì)胞、獼猴紅細(xì)胞以及人粒細(xì)胞[14-15]等。Miura等[8]以ENU為受試物，以40 mg/(kg·d)每隔1 d腹腔給藥3次，采用Anti-CD59/Anti-CD45抗體染色策略，成功在大鼠紅細(xì)胞中檢測(cè)出ENU誘導(dǎo)的Pig-a基因突變。由于成熟的紅細(xì)胞中無(wú)DNA結(jié)構(gòu)，單一檢測(cè)紅細(xì)胞可能在結(jié)果判定上有所影響，因此Miura等在同一項(xiàng)研究中采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法進(jìn)一步檢測(cè)了大鼠脾T淋巴細(xì)胞CD48的缺失情況，綜合判定Pig-a基因突變率。研究結(jié)果顯示ENU誘導(dǎo)的紅細(xì)胞突變率與脾T淋巴細(xì)胞突變率具有一致性。

由于突變細(xì)胞非常稀少，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)需要設(shè)置嚴(yán)格的電壓和(或)熒光補(bǔ)償才能從目標(biāo)細(xì)胞群中鑒別出來(lái)。因?yàn)橥蛔兗?xì)胞缺失表面蛋白標(biāo)記物而被識(shí)別，所以在樣品前處理時(shí)必須保證所有細(xì)胞能夠與各種抗體或反應(yīng)試劑有效地結(jié)合，以及在分析時(shí)保證流式細(xì)胞儀能夠準(zhǔn)確地分辨出標(biāo)記抗體的正常細(xì)胞與未標(biāo)記抗體的突變細(xì)胞。因此，熒光種類和數(shù)目的選擇、合理的設(shè)門策略以及對(duì)熒光信號(hào)重疊的合理解釋是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法的關(guān)鍵所在[16]。

3.1.2 有限稀釋克隆法另一種檢測(cè)方法為有限稀釋克隆法。該方法已用于大鼠脾T細(xì)胞和獼猴外周血T細(xì)胞的Pig-a/PIG-A基因突變檢測(cè)，且在人T淋巴細(xì)胞中已經(jīng)獲得了一些原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)[17]。氣單胞菌溶素前體(proaerolysin，ProAER)是一種細(xì)菌原毒素，淋巴細(xì)胞能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)變?yōu)槎舅?氣單胞菌溶素)。該細(xì)菌毒素直接與正常細(xì)胞的GPI錨(而不是錨鏈蛋白)特異性結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性受損以致細(xì)胞死亡[18]。因此，缺失GPI錨的Pig-a基因突變細(xì)胞能夠在含有ProAER的96孔板內(nèi)生長(zhǎng)集落，而未突變的T淋巴細(xì)胞則死亡。類似于Hprt基因突變?cè)囼?yàn)以6-TG作為選擇劑，有限克隆稀釋法則以ProAER作為選擇劑。其中不同的是，在Hprt基因突變?cè)囼?yàn)中與刺激T淋巴細(xì)胞增殖的分裂素相結(jié)合的受體需要GPI錨的正常表達(dá)，因此在Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)中突變細(xì)胞的增殖方式會(huì)有所不同。

較流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法而言，有限稀釋克隆法能夠更直觀地鑒別突變細(xì)胞，為在體內(nèi)檢測(cè)Pig-a基因突變提供了另一個(gè)選擇，而且該方法的最大優(yōu)點(diǎn)在于獲得的有核突變細(xì)胞可用于更深入的研究，如突變譜的檢測(cè)和突變機(jī)制的分析等。但是，有限稀釋克隆法類似于Hprt基因突變?cè)囼?yàn)，需要體外細(xì)胞培養(yǎng)，耗時(shí)耗力，不便于推廣，而流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，省時(shí)省力，在應(yīng)用方面更具有優(yōu)勢(shì)，更便于常規(guī)的檢測(cè)。因此，目前有關(guān)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)的研究大多數(shù)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法。

3.2 Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)的特點(diǎn)

雖然Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)已在獼猴、大鼠和小鼠等不同物種間開展，但目前針對(duì)該試驗(yàn)方法的研究更多地集中在大鼠上，而且已采用大部分典型的陽(yáng)性遺傳毒性化合物對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。在Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)方法的建立過(guò)程中，研究的主要關(guān)注點(diǎn)在于給藥時(shí)間或給藥方式對(duì)突變率的影響以及試驗(yàn)方法的檢測(cè)窗、靈敏性、特異性、重現(xiàn)性和可轉(zhuǎn)移性等方面。

3.2.1 檢測(cè)窗Miura等[19]研究了在單劑量和累積劑量?jī)煞N給藥方案下ENU誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生的Pig-a突變型紅細(xì)胞在血液中的蓄積效應(yīng)和持續(xù)時(shí)間。F344雄性大鼠分別給予單劑量腹腔注射8.9，35.6或142.4 mg/kg ENU；以及每周1次連續(xù)4周腹腔注射8.9和35.6 mg/kg ENU，于給藥前和給藥后26周里不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)突變紅細(xì)胞(RBCCD59-)的發(fā)生率。研究顯示，單劑量ENU誘導(dǎo)的RBCCD59-發(fā)生率具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性，其最大值開始于給藥后第6周，而且這些顯著的突變率一直持續(xù)至給藥后第6個(gè)月(最后一個(gè)采樣點(diǎn))。而在累積劑量給藥方案中，分4次劑量每周1次給予ENU所誘導(dǎo)的Pig-a基因突變率與相同總劑量單次給藥所產(chǎn)生的突變率相似，即在兩種給藥方案下同一總劑量單次或分次給予ENU所誘導(dǎo)Pig-a基因突變率最大值非常接近。研究結(jié)果表明ENU誘導(dǎo)的Pig-a突變型紅細(xì)胞能夠以近似相加的方式在血液中蓄積，而且一旦在外周血出現(xiàn)就會(huì)存留至少6個(gè)月，這些特征為Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)在亞慢性或慢性研究中檢測(cè)弱致突變物的遺傳毒性提供了可能。

黃色素的主要成分是類胡蘿卜素。類胡蘿卜素是生物體內(nèi)通過(guò)類異戊二烯途徑合成而呈黃色、橙紅色和紅色的一大類萜類色素物質(zhì)[1-2]。類胡蘿卜素又可分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類，胡蘿卜素是不含氧的類胡蘿卜素的總稱，葉黃素則是含氧類胡蘿卜素的總稱。面粉中的類胡蘿卜素，特別是葉黃素和黃酮類物質(zhì)是面粉黃度形成的主要原因[3]。

在上述研究的基礎(chǔ)上，Phonethepswath等[13]觀察了突變型紅細(xì)胞(RBCCD59-和RETCD59-)在大鼠外周血中出現(xiàn)與消除的動(dòng)力學(xué)變化，以探討該試驗(yàn)方法合理的給藥時(shí)間與檢測(cè)窗口期。研究者們分別以ENU、DMBA、N-甲基-N-亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)、4-硝基喹啉-1-氧化物(4-Nitroquinoline-1-oxide，4NQO)和苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)等 5 種典型遺傳毒性陽(yáng)性劑作用于雄性Wistar Han大鼠和SD大鼠(僅限ENU和DMBA)，連續(xù)3天灌胃給藥，于實(shí)驗(yàn)第1、4、15、30、45、90以及180天(僅限ENU)采血，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)受試物誘導(dǎo)產(chǎn)生的RBC突變表型(RBCCD59-)和RET突變表型(RETCD59-)的發(fā)生率；同時(shí)嘗試以染色體損傷作為第2個(gè)遺傳毒性終點(diǎn)結(jié)合至該研究中，于實(shí)驗(yàn)第4天采血檢測(cè)微核網(wǎng)織紅細(xì)胞(Micronucleated Reticulocyte，MN-RET)的發(fā)生率。研究結(jié)果顯示，以上5種陽(yáng)性劑對(duì)兩種不同種屬的大鼠均產(chǎn)生Pig-a基因突變以及染色體損傷。不同受試物誘導(dǎo)的RBCCD59-和RETCD59-發(fā)生率一般從第15天開始出現(xiàn)顯著性遞增：RETCD59-發(fā)生率大約在兩周左右(第15天前后)達(dá)至峰值，而RBCCD59-發(fā)生率則需要大約45天才能達(dá)到峰值。此外，研究發(fā)現(xiàn)ENU誘導(dǎo)的RBCCD59-和RETCD59-持續(xù)存留于Wistar Han大鼠血液中至少6個(gè)月，這些研究結(jié)果與Miura等[24]的研究結(jié)果保持一致。

基于Phonethepswath等[13]的研究，Dertinger等[20]考慮到Pig-a突變型紅細(xì)胞在血液中的蓄積效應(yīng)可能有利于Pig-a突變?cè)囼?yàn)與亞慢性或慢性毒性研究的整合，因此同樣以上述5種典型陽(yáng)性劑在雄性Wistar Han大鼠中開展28天重復(fù)給藥研究，分別于試驗(yàn)給藥前1天，首次給藥后第、15、29和56天采血進(jìn)行外周血RBCCD59-和RETCD59-發(fā)生率的檢測(cè)，同時(shí)于實(shí)驗(yàn)第4天和第29天采血檢測(cè)MN-RET，以探討將基因突變和染色體損傷兩個(gè)遺傳終點(diǎn)整合至28天重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中的可行性，以及觀察這兩個(gè)遺傳終點(diǎn)在該試驗(yàn)系統(tǒng)中的靈敏性。結(jié)果顯示，除了4NQO外，其余4個(gè)受試物均可導(dǎo)致MN-RET的發(fā)生；而所有受試物在28天重復(fù)給藥試驗(yàn)系統(tǒng)中均可誘導(dǎo)Pig-a基因突變。研究表明突變反應(yīng)較早地發(fā)生在RET，且RETCD59-發(fā)生率于實(shí)驗(yàn)第29天接近峰值或達(dá)到峰值；然而，在實(shí)驗(yàn)第29天時(shí)RBCCD59-的發(fā)生率遞增比較溫和，且需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能到達(dá)峰值(大約在第56天)。鑒于RET出現(xiàn)突變反應(yīng)的時(shí)間較RBC早，而且RET出現(xiàn)峰值的時(shí)間與常規(guī)的28天重復(fù)給藥毒性研究的實(shí)驗(yàn)期相對(duì)吻合。因此，Phonethepswath等和Dertinger等均建議將RETCD59-的發(fā)生率作為亞慢性或慢性毒性研究中Pig-a基因突變的檢測(cè)指標(biāo)。

以上這些研究表明，Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)具有較長(zhǎng)的檢測(cè)窗，允許試驗(yàn)過(guò)程中重復(fù)收集樣本檢測(cè)同一動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)的突變率，而且能夠檢測(cè)動(dòng)物經(jīng)重復(fù)給藥后在體內(nèi)蓄積的致突變作用。與其不同的是，一些常用的體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，如微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)，必須在給藥后一個(gè)相對(duì)短的檢測(cè)窗內(nèi)才能檢測(cè)到受試物對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的遺傳毒性。因此，Pig-a突變?cè)囼?yàn)的這些優(yōu)點(diǎn)為其在亞慢性或慢性研究中的應(yīng)用提供了可能。

3.2.2 靈敏性和特異性迄今的研究結(jié)果表明，在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法中大鼠RBC和RET的Pig-a基因自發(fā)突變率非常低(小于5×10-6)[13-14，20]，而在有限克隆稀釋法中脾淋巴細(xì)胞自發(fā)突變的背景值同樣相似[14]。這些紅系細(xì)胞在Pig-a位點(diǎn)上的自發(fā)突變背景值與淋巴細(xì)胞在內(nèi)源性Hprt基因位點(diǎn)上的自發(fā)突變背景值非常具有可比性，而且遠(yuǎn)低于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的自發(fā)突變背景值。報(bào)告基因低頻率的自發(fā)突變能夠有效提升該試驗(yàn)方法的靈敏度，因此這些在Pig-a位點(diǎn)上相對(duì)低的自發(fā)突變背景值有望成為發(fā)展Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)的一大優(yōu)勢(shì)。

對(duì)于RBC和RET的Pig-a的基因突變方面也有一定的差異，Yoshida[21]研究發(fā)現(xiàn)盡管芘在RBC Pig-a和PIGRET基因突變測(cè)中都是陰性，但是溶媒對(duì)照組Pig-a的突變頻率在兩種測(cè)定之間明顯不同。在溶媒對(duì)照組中，對(duì)于RBC Pig-a和PIGRET測(cè)定，試驗(yàn)測(cè)試階Pig-a基因突變的頻率范圍分別為(2.2～4.8)×10-6和(0.3～1.3)×10-6。而在40 mg/kg ENU處理組中，PIGRET基因突變頻率相較于對(duì)照組的倍數(shù)(20.9倍)遠(yuǎn)高于RBC Pig-a的基因突變頻率(13.7倍)。較低的溶媒對(duì)照組PIGRET的突變頻率可以提高該試驗(yàn)的靈敏度，這也是PIGRET基因突變?cè)囼?yàn)的優(yōu)勢(shì)之一。此外，ENU10 mg/kg組和40 mg/kg組，PIGRET基因突變頻率明顯增加在7 d內(nèi)，但RBC在ENU10 mg/kg組需要至少14 d來(lái)檢測(cè)Pig-a基因突變頻率的增加。由于在大鼠外周血中RETs的轉(zhuǎn)化時(shí)間比RBC更短，故PIGRET試驗(yàn)可以比RBC Pig-a試驗(yàn)更早地檢測(cè)ENU的致突變性。

至于鑒定已知致突變物和致癌物的能力方面，一項(xiàng)研究報(bào)道[22]采用41種化合物在大鼠上開展針對(duì)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)靈敏性的驗(yàn)證試驗(yàn)，其中包括26個(gè)在Ames試驗(yàn)中呈陽(yáng)性反應(yīng)的化合物以及一些非遺傳毒性化合物。大部分預(yù)期在試驗(yàn)中呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的受試物均可導(dǎo)致Pig-a基因突變。這些受試物除了包括一些直接與DNA反應(yīng)的烷化劑外，還包括一些經(jīng)體內(nèi)代謝活化后才能暴露出相應(yīng)遺傳毒性的化合物，如2-乙酰氨基芴、馬兜鈴酸、二乙基亞硝胺、B[a]P和DMBA等[23]。這些化合物經(jīng)體內(nèi)充分活化后，其代謝產(chǎn)物因破壞紅系前體細(xì)胞而產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。另一方面，Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)對(duì)于假定的非遺傳毒性化合物也呈現(xiàn)出一定特異性，如鹽酸哌醋甲酯[18]和芘[37]。上述資料顯示，該試驗(yàn)方法已經(jīng)呈現(xiàn)出較高的靈敏性(即檢測(cè)遺傳毒性致癌物的能力)和特異性(即正確識(shí)別所有非遺傳毒性化合物的能力)。

盡管個(gè)別陽(yáng)性劑(如ENU和DMBA)在Pig-a基因位點(diǎn)上的致突變作用較為強(qiáng)烈，但是其他一些化合物(如B[a]P和4-NQO)經(jīng)短期暴露后產(chǎn)生的致突變作用則相對(duì)溫和。在這些情況下，報(bào)告基因相對(duì)低的自發(fā)突變背景值有助于提高試驗(yàn)方法的靈敏性。為了比較Pig-a基因與其他現(xiàn)有的報(bào)告基因?qū)衔镏峦蛔冏饔玫拿舾行裕琈iura等[24]在同一批大鼠上比較了ENU(100 mg/kg)誘導(dǎo)紅細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞在Pig-a基因位點(diǎn)和Hprt基因位點(diǎn)上的突變反應(yīng)。他們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法對(duì)比紅細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的Pig-a基因突變率，同時(shí)使用有限克隆稀釋法對(duì)比T淋巴細(xì)胞在Pig-a基因位點(diǎn)和Hprt基因位點(diǎn)上的突變反應(yīng)。另一個(gè)相似的研究則在少數(shù)獼猴上進(jìn)行，Dobrovolsky等[12]同樣對(duì)比了ENU誘導(dǎo)紅細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞在Pig-a基因位點(diǎn)上的突變反應(yīng)，同時(shí)對(duì)比了T淋巴細(xì)胞的Pig-a基因突變率和Hprt基因突變率。這兩項(xiàng)研究的結(jié)果顯示，無(wú)論是在Pig-a基因位點(diǎn)還是Hprt基因位點(diǎn)上，ENU誘導(dǎo)的紅細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞突變率均具有可比性。此外，Lemieux等[25]采用MutaTMMouse轉(zhuǎn)基因模型對(duì)比研究了連續(xù)28 d重復(fù)給予B[a]P后誘導(dǎo)網(wǎng)織紅細(xì)胞的Pig-a基因突變率和骨髓細(xì)胞的lacZ基因突變率。研究者們發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)基因位點(diǎn)上的突變率均呈現(xiàn)雙倍劑量性遞增，且在不同劑量組中出現(xiàn)非常相似的劑量依賴性動(dòng)力學(xué)變化。盡管這些研究顯示不同報(bào)告基因?qū)衔镏峦蛔冏饔玫拿舾行源嬖诓町悾壳霸谥峦蛔兾锖蛨?bào)告基因沒(méi)有得到充分研究的情況下對(duì)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)的靈敏性下定論尚為時(shí)過(guò)早。

本課題組經(jīng)幾年的實(shí)驗(yàn)研究，形成了本實(shí)驗(yàn)室可行且穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)方法，蒲江等[32]對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行建立、優(yōu)化，并做了進(jìn)一步的評(píng)估。該研究選用合適的陽(yáng)性劑EMU和DMBA，得到與溶劑對(duì)照組相比Pig-a基因突變頻率存在顯著性差異的結(jié)果。陳高峰[15]等采用免疫磁性分離的方法對(duì)試驗(yàn)體系進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化并應(yīng)用于市售的藥物，研究把鹽酸丙卡巴肼與烏拉坦作為受試物采用多終點(diǎn)結(jié)合體內(nèi)遺傳毒性進(jìn)行研究，試驗(yàn)分為3 d和28 d給藥組。研究結(jié)果顯示經(jīng)PCZ與EC短期及長(zhǎng)期暴露后，與對(duì)照組相比RETCD59-和RBCCD59-發(fā)生率均呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性和劑量依賴性變化。兩種受試物在Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)、外周血微核試驗(yàn)、骨髓微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)均呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。

4 體外Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)

隨著動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則的提出，體外Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)的形式能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)的替代，且為體內(nèi)試驗(yàn)提供預(yù)測(cè)形成互補(bǔ)。盡管存在實(shí)際試驗(yàn)需求，但體外Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)在國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展卻十分緩慢。2015年Kruger等[33]人建立了相應(yīng)的Pig-a體外變異體B淋巴母細(xì)胞樣TK6細(xì)胞的檢測(cè)方法，通過(guò)多色流式細(xì)胞術(shù)用抗GPI錨定蛋白CD55和CD59的PE-抗體結(jié)合物檢測(cè)GPI狀態(tài)，對(duì)突變的TK6細(xì)胞樣品進(jìn)行分析，并對(duì)突變體進(jìn)行定量檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)體外Pig-a基因突變法檢測(cè)甲基磺酸乙酯、4-硝基喹啉1-氧化物和UV-c輻射的致突變性，結(jié)果顯示劑量依賴性且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明體外Pig-a試驗(yàn)可以補(bǔ)充體內(nèi)Pig-a試驗(yàn)，與其他哺乳動(dòng)物體外致突變?cè)囼?yàn)相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。隨后，Kruger等[34]又對(duì)TK6細(xì)胞GPI相關(guān)基因型與表型的關(guān)系進(jìn)行了研究。David R[35]在之前研究的基礎(chǔ)上，建立并驗(yàn)證一種對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y體外Pig-a基因突變的檢測(cè)方法，試驗(yàn)中采用的細(xì)胞系與Kruger等有所不同，David R采用小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y代替Kruger試驗(yàn)中采用的TK6細(xì)胞，考慮到TK6細(xì)胞比L5178Y細(xì)胞有較高的Pig-a自發(fā)突變背景值，需清除預(yù)先存在的自發(fā)突變細(xì)胞，降低試驗(yàn)中存在的自身突變對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的影響，L5178Y就以上原因而言存在有一定優(yōu)勢(shì)。

Rees[36]等人主要研究了人類細(xì)胞：TK6細(xì)胞，AHH-1細(xì)胞以及MCL-5細(xì)胞的體外PIG-A的基因突變。由于TK6細(xì)胞自身存在較高的背景突變值，試驗(yàn)中采用了3種不同的方法對(duì)用于優(yōu)化TK6細(xì)胞內(nèi)CD59表達(dá)的富集策略進(jìn)行了比較，研究數(shù)據(jù)表明：熒光激活細(xì)胞分選法在平均CD59野生型富集方面有最佳效果，野生型細(xì)胞富集率達(dá)(95.3±3.0)%，Dynabead?磁珠檢索和克隆擴(kuò)增分別產(chǎn)生(89.1±6.5)%和(70.8±25.3)%的CD59細(xì)胞陽(yáng)性率。在不同的細(xì)胞系之間，該研究表明，MCL-5細(xì)胞內(nèi)的獨(dú)立PIG-A測(cè)定比基于TK6細(xì)胞的測(cè)定更有前途。

5 Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)的應(yīng)用前景

Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)?zāi)軌蚩缥锓N跨組織檢測(cè)體內(nèi)多種類型的突變作用，并能有效整合至其他體內(nèi)試驗(yàn)中，在藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)中具有非常廣闊的應(yīng)用前景，有望成為體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)的新選擇，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有遺傳毒性試驗(yàn)組合的不足。相對(duì)于體外Hprt基因突變?cè)囼?yàn)等以及體內(nèi)試驗(yàn)方法，以外周血紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞為檢測(cè)靶點(diǎn)的Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)具有快速簡(jiǎn)便及實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。而且，該試驗(yàn)方法檢測(cè)窗較長(zhǎng)，允許在試驗(yàn)過(guò)程中重復(fù)采集樣本，無(wú)創(chuàng)、連續(xù)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的突變反應(yīng)，并可在不影響其他檢測(cè)終點(diǎn)的前提下將試驗(yàn)整合至藥物亞慢性或慢性毒性研究中，符合ICH遺傳毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則S2(R1)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則的要求，適應(yīng)當(dāng)前藥物毒理學(xué)研究和安全性評(píng)價(jià)的發(fā)展趨勢(shì)。在基于大鼠外周血的測(cè)定中，通過(guò)熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)來(lái)定量分析紅細(xì)胞表面上缺失CD59的數(shù)目以確定Pig-a突變表型細(xì)胞的頻率。該試驗(yàn)已達(dá)到監(jiān)管的可行性，因此該試驗(yàn)方法建議作為的ICH M7[37]步驟4文件中細(xì)菌突變?cè)囼?yàn)在非S9代謝活化條件下結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)的追蹤實(shí)驗(yàn)。

該方法應(yīng)用于藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)仍需大量的研究和驗(yàn)證工作，以及需要積累更多數(shù)據(jù)對(duì)其方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。除了采用更多的弱致突變物或非致突變物對(duì)方法的靈敏性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證外，還需開展研究證實(shí)GPI錨鏈蛋白的缺失真正源于Pig-a基因位點(diǎn)上的突變，而非由基因沉默或預(yù)先存在的突變體克隆擴(kuò)增而導(dǎo)致。此外，還需研究是否能將該方法應(yīng)用至有核的非紅細(xì)胞系(如粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)或其他實(shí)體組織細(xì)胞上(如肝和腎)。相信在國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域研究人員的共同努力下，Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)定能得到進(jìn)一步發(fā)展與完善，在藥物非臨床遺傳毒性研究以及其他領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。