香煙煙霧與慢性應激聯合暴露對大鼠學習記憶能力的影響

王 倩，黃云飛，雷 磊，蘇德奇*

(新疆醫科大學公共衛生學院毒理教研室，新疆烏魯木齊 830001)

大量流行病學研究證明，高度或長期的精神緊張會導致高血壓、肥胖、焦慮、抑郁等諸多疾病[1]。中國是世界上最大的煙草消費國，吸煙者總數達到3.01億，每年因煙草死亡的人數超過100萬，約占全國死亡人數的12%[2-3]。煙草濫用問題早已受到關注，有研究顯示，緊張會誘發個體對香煙的渴求，經常處于緊張狀態的人群吸煙率較高，增加煙草使用的危險性，從而影響人體健康[4]。近年來對吸煙及緊張狀態的研究大多集中在對暴露于單一因素的研究[5-6]，二者聯合作用對學習和記憶能力影響的研究較少，即吸煙與緊張狀態聯合對機體的危害是否存在交互作用，其作用形式值得深入探討。膽堿能神經遞質參與學習和記憶等相關的重要生理活動[7]。因此本研究采用2×2析因設計，對大鼠進行香煙煙霧、慢性應激單獨及聯合暴露，通過Morris水迷宮實驗，觀察大鼠學習和記憶行為，測定大鼠血清中皮質醇(cortisol，Cort)、乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)、膽堿乙酰轉移酶(choline acetyl transferase，ChAT)濃度和乙酰膽堿脂酶(acetylcholinesterase，AchE)活力以評價香煙煙霧和慢性應激聯合對大鼠學習記憶能力的作用形式，探討香煙煙霧和慢性應激聯合作用對大鼠學習和記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Cort Elisa試劑盒，生產批號201904，購于上海雨朵生物科技有限公司；ACH、CHAT Elisa試劑盒，生產批號201905，購于上海酶聯生物科技有限公司；ACHE試劑盒，生產批號20190516，購于南京建成生物化學試劑有限公司。

恒溫水浴鍋HH-501型，購于常州萬合儀器制造有限公司；UV-2501PC型紫外-可見分光光度計，購于日本Shimadzu公司；Benchmark PLUS型全波長酶標儀，購于BIO-RAD公司；DNP-9082型電熱恒溫培養箱，購于上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗動物及受試物

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量80～120 g，供應于新疆醫科大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SYXK(新)2016-0002。受試物為某品牌過濾嘴香煙，焦油含量18 mg，煙氣煙堿含量1.1 mg。

1.3 動物分組及動物模型制作

大鼠適應性喂養1周后(室溫控制在22～25℃，相對濕度保持在55%～65%，普通喂養)，按照2×2析因設計隨機分為對照組、香煙煙霧組、慢性應激組、聯合干預組，每組10只，雌雄各半，見表1。

表1 動物分組

對照組大鼠不做任何處理。香煙煙霧組進行呼吸道靜式染毒，把大鼠放進40 L的染毒箱內，燃燒香煙，讓香煙充分進入染毒箱內，每天1次，每次10支，每次1 h；慢性應激組通過慢性應激模擬人的緊張，根據文獻[8-9]進行調整，包括雙下肢束縛倒吊、噪音、夾尾、熱蒸汽熏浴、冷水浴5種慢性應激方式，每天隨機給予1種應激方式，每種慢性應激方式不連續應用，預防實驗大鼠產生適應性；聯合干預組同時暴露于香煙煙霧和慢性應激中，大鼠每日先按照慢性應激組處理，后按香煙煙霧組方法進行，4組暴露時間均為12周，每隔兩周稱重并記錄。

利用血清皮質醇濃度來確定慢性應激模型的成功建立[10]。

1.4 實驗動物處理及腦的臟器系數測定

12周染毒結束后，斷食24 h，各組大鼠稱重并記錄，麻醉后處死，腹主動脈采血，血樣于4℃、1 500 r/min離心15 min，取上清，于-80°冰箱保存；迅速取出腦組織，稱取腦質量并計算腦的臟器系數(臟器系數=臟器質量/體質重×100%)。

1.5 病理學觀察

切下大鼠右腦組織并置于4%多聚甲醛中進行固定24～48 h，進行常規石蠟包埋、切片、HE染色及封片，顯微鏡觀察腦組織神經元、膠質細胞、細胞核變化并拍照。

1.6 Morris水迷宮實驗

分別于染毒2、4、8、10、12周時，采用水迷宮實驗對4組大鼠學習記憶能力進行檢測。水中放入奶粉使其變為乳白色，將大鼠任意從四個象限之一面向池壁放入水中，記錄大鼠逃避潛伏期，即大鼠爬上站臺并保持10 s所需時間，若大鼠120 s未找到站臺，則記錄為120 s，每次實驗進行1 d。

1.7 血清中指標測定

采用相應試劑盒測定大鼠血清中ACHE活力，采用相應Elisa試劑盒檢測大鼠血清中Cort、ACH、CHAT含量，各實驗步驟均嚴格按照說明書進行。

1.8 統計學分析

實驗數據用SPSS 24.0軟件分析，計量資料用xˉ±s描述；組間比較用單因素方差分析；交互作用評價用析因設計方差分析；以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠應激模型的確認

與對照組比較，慢性應激組大鼠Cort濃度顯著增加(P＜0.05)，表明慢性應激組大鼠處于緊張狀態，提示模型建立成功，見表2。

表2 各組大鼠Cort檢測結果(n=10，x±s)

2.2 大鼠體質量檢測結果

與對照組比較，香煙煙霧、慢性應激及聯合干預組大鼠體質量差異均無統計學意義(P＞0.05)，聯合暴露對大鼠體質量的影響不存在交互作用(P＞0.05)，見表3和表4。

表3 各組大鼠體質量檢測結果(n=10，x±s，g)

表4 大鼠體質量析因設計資料的方差分析結果

表5 各組大鼠腦質量及腦臟器系數結果(n=10，x±s)

2.3 大鼠腦質量及臟器系數結果

與對照組比較，香煙煙霧、慢性應激及聯合干預組大鼠腦質量及腦臟器系數差異均無統計學意義(P＞0.05)，聯合對大鼠腦質量及腦的臟器系數的影響均不存在交互作用(P＞0.05)，見表5和表6。

2.4 大鼠腦組織病理觀察結果

各組大鼠腦組織經HE染色后的病理形態見圖1，對照組大鼠腦組織神經元形態規則，核膜邊緣清晰，核仁明顯，結構清晰完整。香煙煙霧組大鼠神經元可見輕度核固縮，腦膜血管中度充血及輕度出血，膠質細胞增生。慢性應激組大鼠神經元可見輕度核固縮及輕度淤血。聯合干預組大鼠神經元可見中度核固縮，腦膜輕度淤血及水腫，神經元周圍可見空泡形成。

表6 大鼠腦質量及腦臟器系數析因設計資料的方差分析結果

圖1 各組大鼠腦組織病理學觀察結果(HE染色，10×20)

2.5 大鼠Morris水迷宮實驗結果

與對照組比較，第4、8周慢性應激組逃避潛伏期明顯增加(P＜0.05)，第10周二者單獨及聯合干預組逃避潛伏期均明顯增加(P＜0.05)，且聯合干預組逃避潛伏期最長；與慢性應激組比較，第2周聯合干預組逃避潛伏期顯著減少(P＜0.05)，香煙煙霧與慢性應激聯合暴露存在交互作用(P＜0.05)，交互作用呈拮抗作用(P＜0.05)，見表7和表8。

表7 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期結果(n=10，x±s)

表8 大鼠逃避潛伏期析因設計資料的方差分析結果

2.6 大鼠血清ACH、CHAT含量及ACHE活力

與對照組比較，香煙煙霧、慢性應激單獨及聯合干預組大鼠ACH含量明顯降低(P＜0.05)，慢性應激組ACHE活力升高、CHAT含量降低(P＜0.05)；香煙煙霧與慢性應激聯合暴露對ACH、CHAT含量及ACHE活力均無交互作用(P＞0.05)，見表9和表10。

3 討論

研究發現，慢性應激可導致下丘腦－垂體－腎上腺皮質(HPA)軸激活，從而引起糖皮質激素(GC)分泌升高，造成機體損傷和疾病[10]。近年來，在與慢性應激相關的動物實驗中常將皮質醇濃度升高作為慢性應激模型建立成功的標志[11]。本次研究結果顯示，慢性應激組Cort濃度升高，提示慢性應激模型建立成功。本次研究表明，聯合干預組的大鼠體質量、腦重量及腦臟器系數與對照組差異均無統計學意義，而且經統計學分析未發現存在交互作用，提示在本次實驗條件和觀察期內，香煙煙霧和慢性應激對大鼠生長發育無明顯影響。

表9 各組大鼠ACH、ACHE、CHAT結果(n=10，x±s)

表10 大鼠ACH、ACHE、CHAT析因設計資料的方差分析結果

Morris水迷宮是研究學習記憶能力最常用的工具之一，是目前檢測動物學習記憶能力的最佳工具[12]。本次研究的水迷宮結果發現，第2周時，香煙煙霧與慢性應激聯合干預組的逃避潛伏期明顯減少，呈拮抗作用，提示在本實驗條件下，短期內(2周左右)二者聯合進入機體下可能相互抑制。第10周，香煙煙霧、慢性應激單獨及聯合干預組大鼠逃避潛伏期明顯高于對照組，表明長期(10周左右)的香煙煙霧與慢性應激單獨及聯合暴露均會導致大鼠學習和記憶能力下降，與葛曉東[13]、吳紅芳[14]等的研究一致；此外，第10周開始聯合干預組的逃避潛伏期最長，HE染色結果也表示聯合干預組對腦組織造成的影響最大，提示長時間(10周左右)的聯合暴露后大鼠的學習記憶能力損傷最嚴重。

ACH作為腦內重要的神經遞質，與中樞膽堿能系統密切相關，在學習記憶過程中起著重要作用，當其水平發生變化時，學習記憶能力也會隨之改變。ACH是一種由ACHE水解而成的酶，CHAT是參與ACH合成的關鍵膽堿能標記物，二者共同維持ACH的動態平衡,與ACH的合成有密切關系[15-16]。袁圣楠[17]發現在大鼠學習記憶受損的過程中，腦內神經遞質乙酰膽堿含量降低。本次研究發現，香煙煙霧、慢性應激單獨及聯合干預組大鼠ACH含量顯著降低，這與以往學習記憶相關研究結果一致[18]。慢性應激組ACHE活力升高、CHAT含量降低，而香煙煙霧組CHAT含量及ACHE活力變化并不明顯，提示大鼠學習和記憶能力下降主要是通過造成ACH含量降低來實現的。析因分析結果顯示，香煙煙霧和慢性應激聯合干預對大鼠血清中ACH、CHAT含量及ACHE活力的影響均不存在交互作用，因此尚不能認為香煙煙霧和慢性應激聯合暴露比單獨暴露更容易對大鼠血清中ACH、CHAT含量及ACHE活力產生影響。

綜上所述，香煙煙霧和慢性應激聯合暴露在第2周時，對大鼠學習和記憶能力產生拮抗作用；第10周之后二者單獨及聯合暴露均會引起大鼠學習記憶能力下降，聯合暴露組損傷最嚴重；二者單獨及聯合暴露主要通過造成ACH合成受損，導致大鼠學習和記憶能力下降，聯合暴露對ACH、CHAT含量及ACHE活力的影響未產生交互作用；香煙煙霧和慢性應激聯合暴露的作用形式并非不變，而會因暴露時間、檢測指標的不同而改變，具體作用機制需進一步深入研究。