亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用對肺癌細胞抗氧化和細胞周期蛋白的影響

萬鷹昕，張 平，李 楠

(北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京 100023)

【關(guān)鍵字】亞硒酸鈉；白藜蘆醇；抗氧化；周期蛋白

據(jù)研究表明，肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和威脅最大的惡性腫瘤之一[1]，其中，80%以上為非小細胞肺癌[2]。硒是一種對機體具有生物活性調(diào)節(jié)能力的基本元素，也是生物所必需的微量元素。硒通過自身或中間產(chǎn)物來保護細胞免受自由基的損傷[3-4]。亞硒酸鈉具有腫瘤預(yù)防、化療增敏和促進細胞凋亡的作用[5-6]。亞硒酸鈉還具有抗氧化、消除體內(nèi)的氧自由基與過氧化物、抗炎反應(yīng)、抗高血壓、抗重金屬等藥理作用[7-8]。亞硒酸鈉是目前應(yīng)用最普遍的硒強化劑，但其安全濃度范圍非常窄，高劑量對生物體有毒害作用。

白藜蘆醇是一種普遍存在于自然界的多酚類化合物，近年研究表明，白藜蘆醇對機體無毒副作用，其藥理作用主要是抗氧化、抗自由基等方面，從而預(yù)防癌癥和心血管疾病[9-11]。但白藜蘆醇價格高，且單獨作用于肺癌細胞相對于亞硒酸鈉效果不明顯[12]。為減輕硒作用于癌細胞時的毒副作用，張平等人研究了亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用于肺癌細胞，結(jié)果表明與亞硒酸鈉單獨作用于肺癌A549細胞相比，25 μmol/L白藜蘆醇和亞硒酸鈉的聯(lián)合使細胞的存活率更低，且當亞硒酸鈉濃度≥5 μmol/L時，與對照組相比，肺癌細胞的存活率明顯降低[12]。但相關(guān)機制還不清楚。為此，本論文研究亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用對肺癌細胞抗氧化性和細胞周期蛋白的影響，以便進一步理解亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用對肺癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌A549細胞購于中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學研究所。亞硒酸鈉、白藜蘆醇、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)，購于美國Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶(含EDTA與不含EDTA)、DMEM/F12培養(yǎng)基，購于美國Hyclone公司；細胞凋亡分析試劑盒，購于美國Genview公司；微量谷胱甘肽(glutathione，GSH)測試盒、細胞丙二醛(Malondialdehyde，MDA)測試盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)測試盒，購于南京建成科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

多功能酶標儀、恒溫培養(yǎng)箱，為美國 Thermo公司產(chǎn)品；超凈工作臺，北京百劍空氣凈化設(shè)備廠；TE2000-M倒置顯微鏡，購于日本Nikon公司；BS110S型電子天平，美國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)細胞復(fù)蘇后進行傳代培養(yǎng)。在進行傳代過程中，PBS緩慢沖洗1～3次，勿吹起細胞，用胰蛋白酶酶解細胞，在倒置顯微鏡下觀察，底壁上約80%細胞呈現(xiàn)圓粒狀，細胞間連接將要分離時，迅速吸掉胰酶溶液，避免胰蛋白酶處理過度。然后向100 mm×20 mm培養(yǎng)皿內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液4 mL，小心吹起皿底的細胞，盡量避免產(chǎn)生氣泡，再分裝。

1.3.2 實驗分組實驗組分為對照組、亞硒酸鈉組、白藜蘆醇組、亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用組。根據(jù)張平等人的研究[12]，本實驗將亞硒酸鈉和白藜蘆醇的濃度定為2.0和25.0 μmol/L。對照組含A549細胞和無血清培養(yǎng)基。

1.3.3 四甲基偶氮唑鹽法檢測細胞活性A549細胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，取對數(shù)期的細胞，在96孔板中鋪板，在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加配制好的受試物，處理24 h，吸棄廢液，添加MTT溶液處理4 h，再用DMSO處理10 min，最后用酶標儀檢在532 nm波長處測定D(532)值,按下式計算A549細胞的存活率。

A549 細胞存活率=[D(532)實驗組-D(532)空白組]/[D(532)對照組-D(532)空白組]

空白組為不含A549細胞的實驗組。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和活性氧將對數(shù)生長期的細胞配制成濃度為3×105個/mL的細胞懸液，再于6孔板中按1 mL/孔添加混勻的細胞懸液，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加入受試物，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用檢測細胞凋亡的試劑盒進行處理，最后用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況；同樣，用檢測ROS的試劑盒進行處理，然后用流式細胞術(shù)檢測細胞的ROS情況。

1.3.5 酶標儀檢測谷胱甘肽、丙二醛的表達水平將對數(shù)生長期的細胞配制成濃度為3×105個/mL的細胞懸液，再于6孔板中按1 mL/孔添加混勻的細胞懸液，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加入受試物，接著培養(yǎng)24 h。分別用檢測GSH、MDA試劑盒進行處理，最后用酶標儀檢測GSH、MDA的表達水平。

1.3.6 Western blot檢測P-Rb蛋白實驗分組同1.3.2，用藥物處理A549細胞后，收集細胞，提取總蛋白，然后用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白樣品濃度。上樣同樣質(zhì)量總蛋白后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃孵育過夜，用TBST洗后，加入二抗，室溫孵育2 h，用TBST洗后，用化學發(fā)光試劑盒檢測P-Rb蛋白表達；用顯影儀掃描并拍照，對顯示的目的蛋白和相應(yīng)β-actin的條帶進行灰度分析，以目的蛋白和內(nèi)參β-actin條帶灰度的比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計分析

所有計量資料以平均值±標準差(xˉ±s)的形式表示，用SPSS軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析判斷各處理組之間的差異顯著性，LSD Duncan法檢驗進行兩兩比較，并用Origin作圖軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用對肺癌A549細胞存活率和凋亡率的影響

采用四甲基偶氮唑鹽法檢測細胞活性，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，結(jié)果見表1。與對照組相比，2 μmol/L亞硒酸鈉單獨處理可使A549細胞存活率降低、凋亡率升高(P＜0.01)；25 μmol/L白藜蘆醇單獨處理后細胞存活率和凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。當亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用后，細胞的存活率降低至46.867%，且凋亡率上升至3.790%，相較于兩個單獨處理組，其存活率和凋亡率與對照組的差異性更為顯著(P均＜0.01)，這說明聯(lián)用組能降低細胞的存活率，促進A549細胞凋亡。

表1 亞硒酸鈉與白藜蘆醇鈉對A549細胞存活和凋亡的影響

圖1 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對A549細胞GSH和MDA表達水平的影響

2.2 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對A549細胞GSH和MDA表達水平的影響

用酶標儀檢測A549細胞中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的表達水平，結(jié)果見圖1。亞硒酸鈉與白藜蘆醇單獨處理組GSH表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用組較對照組和單獨處理組的GSH表達水平顯著降低(P＜0.05)。

亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨處理組MDA表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，但亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用組MDA表達水平與對照組比較顯著升高(P＜0.05)。結(jié)果表明，亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用后對細胞造成了一定的氧化損傷。

2.3 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對A549細胞ROS水平的影響

亞硒酸鈉和白藜蘆醇對A549細胞ROS水平的影響見圖2和表2。與對照組相比，亞硒酸鈉單獨處理可顯著增加A549細胞內(nèi)ROS水平(P＜0.05)，白藜蘆醇單獨處理可顯著降低A549內(nèi)ROS水平(P＜0.05)，而亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用后，細胞內(nèi)ROS表達水平與對照組和白藜蘆醇單獨處理組相比顯著升高(P＜0.05)，與亞硒酸鈉單獨處理組相比差異無統(tǒng)計學意義。表明亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用能導致ROS水平升高。

表2 不同組別A549細胞ROS和周期蛋白相對表達量

2.4 亞硒酸鈉聯(lián)合白藜蘆醇對細胞周期蛋白P-Rb的影響

Rb是一種抑癌基因表達的蛋白，可以通過調(diào)控細胞周期G1期的檢驗點來調(diào)節(jié)細胞增殖。Western blot檢測P-Rb蛋白的表達，結(jié)果見圖3和表2。與對照組相比，亞硒酸鈉組A549細胞的P-Rb蛋白表達水平降低(P＜0.05)，白藜蘆醇組A549細胞的P-Rb的表達水平與對照組間的差異無統(tǒng)計學意義；但亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)用組p-Rb的水平較對照組、亞硒酸鈉組和白藜蘆醇組單獨處理組均顯著降低(P＜0.05)。

圖2 流式細胞術(shù)檢測不同組別A549細胞ROS水平

圖3 Western blot檢測結(jié)果條帶

3 討論

亞硒酸鈉是一種對機體細胞有一定毒性作用的無機硒化合物，白藜蘆醇是從植物體內(nèi)提取出來的天然活性成分且在一定范圍內(nèi)對機體細胞無毒副作用。亞硒酸鈉(2 μmol/L)和白藜蘆醇(25 μmol/L)單獨處理A549細胞時，細胞存活率分別為77.43%和111.67%，但兩者聯(lián)合處理后，細胞存活率為46.87%。生物體供能的主要來源和合成ATP激素及許多生理活性所不可缺少的物質(zhì)都是氧。但機體在利用氧的同時，氧自身也發(fā)生了一系列反應(yīng)，生成包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥自由基等氧自由基或活性氧簇的ROS。而ROS生成后一般會被一些特定的酶類清除。當細胞內(nèi)自由基生成過量或抗氧化防御系統(tǒng)受損時，ROS的產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡遭到破壞，導致ROS水平升高。ROS的大量堆積會引起細胞氧化應(yīng)激或脂質(zhì)過氧化等，最終使細胞凋亡或死亡[13]。機體參與抗氧化作用的酶主要包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等。若這一機制受到損傷，則多余氧自由基就會直接作用于機體，導致機體損傷。當各種致癌因素使氧自由基產(chǎn)生過量、機體抗氧化和修復(fù)機制受損時，機體就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激的損傷，并導致各種腫瘤的產(chǎn)生。捕捉和清除自由基、保護DNA蛋白質(zhì)等生物大分子免受活性氧損害，才能抑制腫瘤生長[14]。GSH是細胞內(nèi)重要的自由基清除劑，可以與細胞內(nèi)的自由基或超氧離子反應(yīng)，拮抗細胞的氧化損傷。通過細胞內(nèi)GSH表達水平的測定，可以反映出細胞內(nèi)的氧化還原水平。MDA是細胞脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一。可以通過細胞內(nèi)MDA的表達水平了解細胞膜脂質(zhì)過氧化程度，從而間接了解細胞膜系統(tǒng)受損程度。本研究結(jié)果顯示，亞硒酸鈉單獨處理后，A549細胞內(nèi)GSH表達水平有所降低，MDA表達水平和ROS表達水平有所升高。白藜蘆醇單獨處理后，細胞內(nèi)ROS表達水平降低，而GSH和MDA表達水平的活力均無顯著性變化。亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用后與亞硒酸鈉單獨處理相比，ROS表達水平有所上升，GSH表達水平降低和MDA表達水平升高。ROS在細胞中具有雙重的功能，其既能通過DNA損傷和線粒體途徑誘導細胞凋亡，也能通過激活其它信號通路來調(diào)節(jié)細胞的生存或死亡狀態(tài)。

細胞周期調(diào)控在細胞增殖和凋亡中起重要的作用。張平等[12]在研究亞硒酸鈉與白藜蘆醇聯(lián)合應(yīng)用對肺癌細胞的協(xié)同作用的實驗中發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用能夠阻滯肺癌A549細胞于細胞周期的G0/G1期。聯(lián)用組肺癌A549細胞P-Rb蛋白的相對蛋白質(zhì)表達水平差異顯著(P＜0.05)，這可能可以解釋聯(lián)用使肺癌A549細胞的細胞周期處于G0/G1期，無法繼續(xù)進行細胞分裂，最終導致肺癌A549細胞凋亡。

本研究分析和評價了亞硒酸鈉和白藜蘆醇單獨處理和聯(lián)用對肺癌細胞拮抗的效果，通過比較單獨處理和聯(lián)用對A549細胞的細胞存活和凋亡、GSH、MDA、ROS的檢測得出如下結(jié)論：與對照組相比，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯(lián)合降低了肺癌A549細胞的存活率，促進其凋亡；同時，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯(lián)合應(yīng)用降低GSH的表達水平，增加MDA和ROS的表達水平。降低周期蛋白P-Rb的表達水平，阻滯細胞于細胞S期。通過研究亞硒酸鈉和白藜蘆醇聯(lián)用對肺癌細胞的抗氧化性研究可以得出，亞硒酸鈉和白藜蘆醇的聯(lián)用對肺癌細胞有抑制增殖、促進凋亡的作用。其機制可能與增加氧化損傷及降低P-Rb蛋白表達有關(guān)。