甲基丙烯酸環氧丙酯的遺傳毒性評價

王全凱，謝廣云，馬順鵬 ，郭浩然，烏瀚寶櫟爾，宋佳陽，許建寧，*

(1.中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所，北京 100050；2.江陰市疾病預防控制中心，江蘇 無錫 214434；3.中國疾病預防控制中心化學污染與健康安全重點實驗室，北京 100050)

甲基丙烯酸環氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)，又稱甲基丙烯酸縮水甘油酯，作為聚合反應單體的一種，在食品包裝材料的內表面涂層有廣泛應用；同時，還是牙科治療材料中樹脂和粘合劑的重要組分[1-2]。研究表明，GMA屬于低毒類化學物質，具有明顯的刺激性，可引發豚鼠皮膚的速發型和遲發型變態反應，多項致突變試驗結果陽性，長期暴露存在生殖發育毒性，也具有潛在致癌性[3]。目前，對其遺傳毒性的系統評價仍缺少足夠的實驗室證據，毒性機制有待進一步闡明。

體外哺乳動物細胞微核試驗是評價化學物質遺傳毒性的主要手段。在不同劑量受試物暴露的條件下，通過觀察分裂間期細胞的微核形成數量，來反映細胞染色體斷裂和非整倍體作用的活性改變，基于此評價受試物的遺傳毒性[4-5]。本研究以中國倉鼠肺細胞(V79)為對象，對不同劑量GMA誘發其細胞的微核發生率進行評價，為進一步研究GMA的毒性作用機制提供證據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與試劑

甲基丙烯酸環氧丙酯，購于美國Sigma公司，CAS號106-91-2，分子式C7H10O3，熔點＜-50℃，沸點189℃，密度1.042 g/mL(25℃)。MEM培養基購于美國Life Technologies公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于美國Gibco公司；細胞松弛素B、Giemsa染料、絲裂霉素C和環磷酰胺均購于美國Sigma公司；雙抗(青鏈霉素混合液)購于北京Solarbio公司。

CO2培養箱購于美國Thermo公司；超凈工作臺購于北京東聯哈爾儀器制造有限公司；臺式高速離心機購于BECKMAN公司；倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；生物顯微鏡購于日本Nikon公司。中國倉鼠肺細胞(V79)，購于中國科學院典型培養物保藏中心昆明細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養液氮凍存的V79細胞復蘇后，加入含10%FBS的MEM培養液，置37℃、CO2體積分數為5%的C02培養箱中培養。待細胞長滿85%瓶底面積左右，加入0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3進行傳代，接種于25 cm2細胞培養瓶中繼續培養。期間觀察、記錄各瓶細胞生長及形態變化。取對數生長期的V79細胞用于實驗。

1.2.2 細胞毒性實驗本課題組通過預實驗確定GMA對V79細胞的絕對致死濃度(LC100)70 μg/mL，因此選擇終濃度 20、30、40、50、60 和 70 μg/mL 的GMA進行染毒處理，每個濃度組設3個平行樣，同時設DMSO溶劑對照；置培養箱中24 h后，0.25%胰酶消化收集細胞制成單細胞懸液，經過臺盼藍染色后，使用計數板分別計數活細胞和死細胞數量，每個濃度組重復計數3次，計算細胞存活率。

細胞存活率/%=同一濃度組活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%

相對存活率/%=同一濃度組的平均活細胞數/DMSO溶劑對照組平均存活細胞數×100%

1.2.3 V79細胞的體外微核實驗及評價使用濃度分別為2.25、4.5、9.0、18.0、36.0 μg/mL的GMA染毒V79細胞，設置空白對照組、DMSO對照組和陽性對照組。3 h處理組分別在加和不加體外活化系統(S9)條件下開展微核試驗評價，24 h處理組只在不加S9條件下進行。無S9條件下，0.5 μg/mL的絲裂霉素C作為陽性對照；有S9條件下，5 μg/mL的環磷酰胺為陽性對照。GMA染毒V79細胞3 h后，更換新的MEM培養液和終濃度為5 μg/mL的細胞松弛素B(cyto B)，繼續培養至24 h收獲細胞。GMA接觸V79細胞24 h處理組，染毒結束后收獲細胞。

體外微核試驗采用經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)發布的《體外哺乳動物細胞微核試驗方法及評價標準》(No.487)[6]。細胞培養至24 h后收獲細胞，加入0.075 mol/L KCI溶液5 mL，使用固定液(V甲醇∶V冰醋酸=4∶1)反復固定，最后使用Giemsa染液進行染色。在光學顯微鏡下(×40)觀察，要求每個劑量組觀察不少于2 000個雙核細胞，并記錄含有微核的雙核細胞數，計算微核細胞率；此外，至少觀察500個細胞，通過計算復制指數，評價V79細胞的增殖情況。

微核細胞率/‰=觀察到含微核的細胞數/觀察的總雙核細胞數×1 000‰

復制指數/%=雙核細胞數/(雙核細胞數+單核細胞數)×100%。

1.3 統計學方法

采用SAS9.0統計軟件進行數據分析，細胞復制指數和雙核細胞微核率的比較采用卡方檢驗，線性回歸模型用來分析濃度和效應的相關性。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 GMA對V79細胞的毒性作用

細胞毒性試驗的結果如表1所示，隨著染毒劑量的增加，V79細胞的存活率降低，呈濃度-效應關系(R2=0.892，P＜0.01)。經計算，GMA半數致死濃度(LC50)為35.2 μg/mL。根據細胞毒性實驗結果，選用2.25～36.0 μg/mL劑量范圍作為V79細胞微核試驗的染毒劑量。

表1 GMA對V79細胞的毒性作用

2.2 GMA對V79細胞復制指數的影響

GMA染毒的不同劑量組的細胞復制指數結果見表2，在加與不加S9條件下，各染毒劑量組復制指數的變化均在正常范圍之內，未見GMA對V79細胞復制指數產生明顯影響。

2.3 GMA對V79細胞微核率的影響

圖1為V79細胞染色固定后的顯微鏡下圖，GMA染毒劑量在2.25～36.0 μg/mL范圍內，V79細胞微核率的結果見表3。在無S9條件下，與DMSO溶劑對照組相比，隨著GMA染毒濃度的增加，3和24 h組的V79細胞微核率均逐漸升高，呈明顯的濃度-效應關系(3 h 染 毒 組R2=0.967，P＜0.01；24 h 染 毒 組R2=0.959，P＜0.01)，其中在 9.0、18.0、36.0 μg/mL 濃度組的微核細胞率的差異有統計學意義(P＜0.05)。有S9條件下，與對照組相比，各劑量組GMA接觸3 h的微核細胞率的差異均無統計學意義(P＞0.05)。

表2 GMA染毒V79細胞復制指數結果

圖1 顯微鏡下觀察V79細胞染色固定后的雙核細胞(×40)

3 討論

甲基丙烯酸環氧丙酯作為雙官能團單體的一種，具有環氧基團的親電性、雙鍵烷化的特性，提示GMA可能會對細胞造成氧化性損傷或直接作用于DNA，造成染色體損傷[7]。雖然美國食品藥品監督管理局(FDA)將其列為可與食品接觸的材料，但目前對于人群每日的潛在接觸和攝入程度尚不清楚。隨著GMA在食品包裝材料及醫療材料領域的廣泛應用，GMA的職業暴露和消費者接觸攝入對人類健康的影響越來越引發人們的關注[2]。

受試物的非整倍體劑和斷裂劑效應是誘發染色體潛在損傷的基礎，而體外哺乳動物細胞微核試驗能夠同時檢測到這兩種誘發效應。當微核來源于滯后的整條染色體時，運用本方法的檢測分析比傳統的染色體畸變試驗更為有效[9]，OECD將其作為非整倍體劑和染色體斷裂劑誘發效應的標準替代方法。越來越多的研究表明，無論是在用或不用細胞松弛素B處理的情況下，在CHO、V79、CHL/IU和L5178Y等嚙齒類細胞株以及人淋巴細胞進行試驗都是非常有效的[10-11]。在國際遺傳毒性技術科學委員會開展的合作研究和國際遺傳毒性試驗工作組的報告框架中，體外哺乳動物細胞微核試驗結果也是必不可少的內容。

在本研究中，選擇2.25～36.0 μg/mL的GMA染毒劑量范圍處理V79細胞，對GMA誘發V79細胞的遺傳毒性進行評價。在加或不加S9條件下，各染毒劑量組均未見GMA對V79細胞復制指數產生明顯影響，這表明在此濃度范圍內，GMA對V79細胞的增殖無影響。在無S9條件下，與對照組相比，染毒3和24 h處理組的V79細胞的微核率均逐漸升高，并呈明顯的濃度-效應關系，其中高濃度組V79細胞的微核率差異有統計學意義，提示GMA可以誘發V79細胞的染色體或紡錘體損傷，這與課題組早期的GMA致突變研究有良好的相關性[12]。在加S9條件下，染毒3 h的高劑量組微核細胞率與對照組相比，兩者的差異無統計學意義。由于缺乏體內代謝活化系統是影響體外微核試驗結果的因素之一，只有經代謝活化后，化學物質的毒性檢測才盡可能接近人體真實接觸的毒作用情況[6]。而在體內微核試驗的研究中，發現經口染毒只有在高劑量組骨髓細胞微核率升高，在腹腔注射染毒的微核試驗研究中，未發現細胞微核數量存在劑量-反應關系[13]。

綜上所述，在本實驗室條件下，GMA濃度在2.25～36.0 μg/mL范圍內，可致V79細胞的微核率升高，表明GMA可誘發遺傳物質損傷，具有遺傳毒性。