深圳和太原PM2.5樣品致突變作用研究

鄭 凱，王冰玉，徐新云*，耿 紅，黃海燕劉 威龍鼎新

(1.深圳市疾病預防控制中心環境與健康所，廣東 深圳 518055；2.南華大學公共衛生學院，湖南 衡陽 421001；3.山西大學環境科學研究所，山西 太原 030006)

大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是指空氣顆粒物中動力學當量直徑≤2.5 μm的顆粒物，是空氣污染物的主要成分之一。PM2.5的成分十分復雜，包含多環芳烴、重金屬離子、硝酸鹽、亞硝酸鹽等多種具有致突變性和致癌性物質，對人類健康造成了很大威脅[1-3]。PM2.5由于粒徑小、比表面積大、活性強、極易富集有毒有害物質，而且可較長時間停留在空氣中，易被吸入肺泡并沉積，損害人體健康，當接觸達到一定劑量后能夠引起呼吸系統疾病、心血管疾病和肺癌等多種疾病的發生[4-6]，國際癌癥機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)于2013年發布報告將PM2.5列為致癌物。Ames試驗是1975由Bruce N.Ames建立的一種檢測致突變性的試驗[7-8]，其原理是鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養缺陷型(his-)菌株在含微量組氨酸的培養基中，只有少數的細菌發生自發回復突變，形成在顯微鏡下才能看到的菌落。受誘變劑作用后，大量的細菌發生回復突變，自行合成組氨酸，形成肉眼可見的菌落。TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535均屬于組氨酸缺陷型菌株，因此在Ames試驗中被廣泛使用。

山西太原作為我國的煤炭和重工業基地，是受霧霾天氣影響非常嚴重的地區之一；深圳作為我國經濟特區之一，其環境質量雖然在優良水平，但近幾年也有少數時間受霧霾天氣的侵擾。眾所周知，在霧霾的組成成分中PM2.5對人類的健康影響大，因此本文利用Ames試驗中組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535，使用平板滲入法通過Ames試驗檢測深圳和山西太原PM2.5樣品是否具有致突變作用，為深入研究PM2.5的致癌致突變分子機制、保護人類健康提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535購自美國MOLTOX公司；生物分子學瓊脂糖(certified molecular biology agarose)購自Bio-Rad公司；氧化型輔酶Ⅱ鈉鹽NADP Na2購自Solarbio公司；哺乳動物微粒體酶(S9)購自美國MOLTOX公司；D-生物素和L-組氨酸購自美國Sigma公司，D-葡萄糖6-磷酸鈉鹽(D-glucose 6-phosphate sodium salt)、四環素、氨芐青霉素購自Aladdin-e公司，營養肉湯和營養瓊脂購自廣州環凱生物科技有限公司，葡萄糖購自購自美國Sigma公司，迭氮鈉購自天津市福晨化學試劑廠，敵克松(fenaminosulf)購自AccuStandard公司，2-氨基芴(2-aminofluorene)購自J&K ScientificLTD公司，1,8-二羥基蒽醌(1,8-dihydroxyanthraquinone)購自美國AcrosOrganics公司。

1.2 菌株鑒定

按常規方法進行自發回變率、組氨酸缺陷型、四環素抗性、脂多糖屏障(raf)缺陷型、R因子(氨芐青霉素抗性)和紫外損傷(uvrB)修復的鑒定。

1.3 PM2.5樣品制備

分別在深圳和太原兩地采集PM2.5樣品，使用中流量大氣采樣器TH-150F，采樣流速100 L/min，采樣時間24 h，使用直徑為90 mm的濾膜收集PM2.5顆粒。將分別在深圳和太原采集好的3張PM2.5的濾膜稱重后剪成2 cm×2 cm大小分別放于帶標記的兩個燒杯中，并使有顆粒的一面朝上，加150 mL超純水使濾膜完全侵沒，用一層錫箔紙使燒杯口密封，超聲提取30 min，用干凈的鑷子將燒杯中的濾膜取出，待PM2.5樣品懸濁液冷卻后分別轉移到兩個真空冷凍物料盤中并標記，用錫箔紙將物料盤口密封后放于-80℃冰箱冷凍24 h，再將物料盤口的錫箔紙取下，用封口膜密封并在封口膜上點許多密集的小孔，放在真空冷凍干燥機中干燥24 h(干燥時間由樣品的多少決定)使PM2.5完全干燥，將物料盤敞口放在無菌工作臺中照紫外燈2 h，用超純水溶解PM2.5樣品，收集PM2.5樣品溶液，-20℃保存待用。

1.4 Ames試驗

將深圳和太原PM2.5樣品分別用滅菌的超純水稀釋至0.4、1.0、2.0和4.0 mg/mL共4個濃度，作為受試物進行Ames試驗[7-9]。同時設置溶劑對照組和陽性對照組。陽性對照組不加S9時，TA97、TA98和TA102按每皿加入50 μg的敵克松，TA100和TA1535按每皿加入1.5 μg的疊氮鈉；陽性對照組加S9時，TA97、TA98、TA100和TA102按每皿加入10 μg的2-氨基芴，TA1535按每皿加入50 μg的二羥基蒽醌。采用平板滲入法，在2 mL頂層瓊脂中分別加入0.1 mL的菌液和0.1 mL的受試物，代謝活化組加入0.5 mL S9混合液，混勻后倒入底層培養基平板上并鋪平。同時設置空白對照組(即陰性對照組或溶劑對照組)和陽性對照組。每個組均設3個平行皿，37℃培養48 h后，計數每個平皿的回變菌落數。

1.5 統計分析

實驗數據以xˉ±s表示，所有實驗重復3次，用SPSS 24.0和Excel進行統計分析，各樣本實驗組和對照組以及加S9混合液和不加S9混合液的均數差異分析采用單因素t檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 菌株鑒定結果

組氨酸鑒定：5種菌株在不加組氨酸的培養基上均不能生長，在加入組氨酸的培養基上均能生長。raf鑒定：TA97、TA98、TA100和TA102菌株在結晶紫滲透的培養基區域上均有抑制帶，TA1535菌株在結晶紫滲透的培養基區域上沒有抑制帶。四環素抗性鑒定：只有TA102菌株在有四環素的區域生長，其余4種菌株不能生長，只有TA102菌株具有抗四環素效應。R因子鑒定：TA97、TA98、TA100和TA102菌株在氨芐青霉素帶周圍可以生長，這4種菌株具有抗氨芐青霉素效應，說明具有R因子，TA1535菌株在氨芐青霉素帶周圍生長受抑制，不具有抗氨芐青霉素效應，說明不具有R因子。uvrB修復缺陷鑒定：TA97、TA98、TA100和TA1535菌株僅在沒有紫外線照射過的一半培養基上生長，為uvrB修復缺陷型菌株，TA102菌株經紫外線照射過后能生長，TA102菌株具有uvrB修復。自發回變率的測定：5種菌株的自發回變率均在標準范圍之內。菌株基因型和自發回變鑒定結果均符合使用標準，見表1。

表1 鼠傷寒沙門菌5種菌株生物學特性鑒定結果和自發回變率

2.2 深圳樣品的Ames試驗結果

4種不同濃度的深圳PM2.5樣品的水溶液加S9混合液與不加S9混合液均引起TA97回變菌落數大于空白對照組(即陰性對照組或溶劑對照組)的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA98在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液后回變菌落數達到(34.0±9.1)個/皿，超過了陰性對照組[(14.3±2.6)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA100在PM2.5樣品濃度為100 μg/皿和200 μg/皿時不加S9混合液的回變菌落數達到(408.0±42.8)和(2 726.0±615.9)個/皿，超過了陰性對照組[(172.0±14.7)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA100在PM2.5樣品濃度為200 μg/皿和400 μg/皿時加S9混合液的回變菌落數達到(2896.7±175.1)和(2201.3±228.6)個/皿，超過了陰性對照組[(153.3±14.5)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA102在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液的回變菌落數達到(312.0±23.0)個/皿，超過了陰性對照組[(149.3±26.2)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA1535在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時不加S9混合液的回變菌落數達到(32.3±1.7)個/皿，與陰性對照組[(26.0±0.8)個/皿]相比有顯著性差異(P＜0.01)。TA97在 PM2.5樣品濃度為200 μg/皿和400 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數達到(1 358.7±79.8)個/皿、(1 586.7±101.5)個/皿，分別與不加S9混合液的菌落回變數(900±46.3)個/皿、(1 039.3±68.9)個/皿相比差異有統計學意義(P＜0.01)。TA100和TA102在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數達到(2 201.3±228.6)個/皿和(312.0±23.0)個/皿，分別與不加S9混合液的菌落回變數(124.7±9.7)個/皿和(157.7±19.9)個/皿相比差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

2.3 太原樣品的Ames試驗結果

四種不同濃度的太原PM2.5樣品的水溶液加S9混合液與不加S9混合液均引起TA97回變菌落數大于空白對照組(即陰性對照組或溶劑對照組)的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA98在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時不加S9混合液后回變菌落數達到(98.3±15.1)個/皿，超過了陰性對照組[(19.3±5.7)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA98在PM2.5樣品濃度為40、200和400 μg/皿時加S9混合液后回變菌落數達到(85.0±5.4)、(33.0±3.6)和(141.0±8.2)個/皿，超過了陰性對照組[(14.3±2.6)個/皿]的 2倍，可判為 Ames試驗陽性。TA100在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時不加S9混合液后回變菌落數達到(926.7±33.0)個/皿，超過了陰性對照組[(172.0±14.7)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA100在PM2.5樣品濃度為40和400 μg/皿時加S9混合液后回變菌落數達到(425.3±21.7)和(5 125.3±215.6)個/皿，超過了陰性對照組[(153.3±14.5)個/皿]的2倍，可判為Ames試驗陽性。TA102在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數達到(247.0±41.1)個/皿，與陰性對照組[(149.3±26.2)個/皿]相比差異有統計學意義(P＜0.05)。TA97在PM2.5樣品濃度為40和200 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數達到(2 970.7±343.2)個/皿和(3 428.0±295.2)個/皿，分別與不加S9混合液的菌落回變數(370.0±76.1)個/皿和(1 754.7±137.2)個/皿相比差異有統計學意義(P＜0.01)。TA98和TA100在PM2.5樣品濃度為400 μg/皿時加S9混合液后菌落回變數達到(141.0±8.2)個/皿和(5 125.3±215.6)個/皿，分別與不加S9混合液的菌落回變數(98.3±15.1)個/皿和(926.7±33.0)個/皿相比差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表2。

表2 深圳與太原PM2.5樣品的Ames試驗菌株自發回變數結果

3 討論

本試驗結果顯示廣東深圳和山西太原兩個地區的PM2.5均具有致突變性，Bocchi[10]等人研究結果顯示，PM2.5的提取物能夠引起DNA損傷并在菌株回復突變試驗的結果中表明具有致突變性，這與本文試驗結果一致。

由于PM2.5的直徑比較小，可通過呼吸系統經支氣管直接進入到肺泡深處，并在肺泡沉積，達到一定劑量后可引起機體發生炎癥反應、氧化應激反應以及誘導基因突變，對人體健康造成嚴重危害。最近幾年來我國部分城市出現霧霾現象越來越嚴重，特別是京津冀、長江三角洲及珠江三角洲等地區的霧霾現象更為明顯。有研究表明，杭州在2001年霧霾天氣只有12天，而在2013年霧霾天氣增加到293天[11]。霧霾天氣的增加對人群健康都來很大影響，其中霧霾中對人類健康影響最大的部分是PM2.5。文獻報道PM2.5暴露與肺癌的形成密切相關，PM2.5含有的硝酸鹽、亞硝酸鹽等化合物以及重金屬元素能夠經呼吸道進入肺泡深部，并在肺泡深部沉積，直接或者間接的作用與支氣管粘膜，引起肺上皮細胞發生基因突變[12]。隨著近20年來的霧霾天氣加重，我國肺癌發病率也明顯升高。流行病學調查結果表明，昆山市2006年肺癌發病率為48.58/100萬，而2015年肺癌發病率增加到77.72/100萬，同比增長59.98%[13]；江西省2010—2014年肺癌發病率由38.62/100萬上升至43.92/100萬，同比增長13.72%[14]；江蘇省淮安市2009年肺癌發病率為28.36/100萬，2013年肺癌發病率上升到40.17/100萬，同比增長41.64%[15]。這些研究表明，近年來肺癌發病率增加與霧霾天氣增重有著密切的關系。

由于PM2.5成分比較復雜，現有資料表明，PM2.5含有大量的重金屬和多環芳烴類化學物，而部分重金屬和多環芳烴具有致突變性和潛在致癌性[16-18]。Gilli報道意大利都靈環境中PM2.5具有致突變性[19]，Belcik發現PM2.5具有基因毒性與細胞毒性[20]。本文采用Ames試驗檢測分析深圳和太原PM2.5樣品是否具有致突變作用，Ames試驗是檢測環境污染物或外來化學物質致突變作用的經典實驗，如果樣品在不加S9條件下引起測試菌株突變稱為直接致突變作用，如果樣品需要在加S9條件下通過體內代謝活化才能引起測試菌株突變，則稱之為間接致突變作用。本文利用5種組氨酸缺陷型沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535檢測廣東深圳和山西太原兩地區PM2.5樣品的致突變作用，本試驗設立陽性對照組在加S9與不加S9活化條件下，5種菌株的回變菌落數均超過陰性對照組回變菌落數的2倍，說明本試驗的研究體系完全符合要求而且具有可行性。加S9與不加S9活化條件下，TA97菌株在深圳和太原兩個地區PM2.5樣品各個濃度的回變菌落數均超過陰性對照組2倍，深圳和太原兩個地區的PM2.5樣品Ames試驗判為陽性，且加S9活化后回變菌落數明顯升高，說明深圳和太原兩地區PM2.5同時具有直接致突變和間接致突變作用。雖然本文使用的深圳和太原PM2.5樣品暫未公布成分檢測結果，但有作者報道太原PM2.5含As、Cd、Cu、Ni、Pb等重金屬濃度較高[16]，文獻報道As、Cd、Ni都具有一定的致癌致突變作用，可引起癌基因表達改變[17-18]，因此本文獲得的Ames實驗結果是非常有價值的，充分說明深圳和太原PM2.5樣品中存在一些致突變環境污染物，對于今后深入研究霧霾致癌致突變的分子機制提供了科學依據，同時對于保護環境和保護人群健康具有十分重要的理論意義與科學基礎。