促紅細胞生成素對肝癌生長影響的臨床研究

李瑞芹 鄭海濤 蘇偉民 陳鳳燕

普寧市人民醫院 （普寧515300）

肝細胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤，且發展迅速，短期內病死率高，嚴重威脅著人們的健康［1］。腫瘤的發生發展及轉移離不開腫瘤組織新生血管的形成，腫瘤新生血管是腫瘤形成和發展的基礎［2］。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）及促紅細胞生成素受體（EPO receipter，EPOR）除了調節紅系的發生與發展外，其在多種非紅系組織細胞中也有表達［3］。最新的研究表明，EPO作為一種內源性促血管生成因子參與了多種人類惡性腫瘤的發生發展，它促進腫瘤血管生成、腫瘤細胞的生長，抑制腫瘤細胞凋亡，有益于腫瘤細胞在缺氧的環境中存活［4］。對血管生成及調節的具體機制的研究有助于為HCC的抗血管生成治療提供新的治療靶點。HCC是典型的多血管腫瘤，研究表明HCC的預后與腫瘤的微血管密度（microvessel density，MVD）有關［5］。但HCC中EPO和EPOR表達情況及其于MVD之間的關系卻鮮見報道。基于以上，本研究采用酶聯免疫吸附實驗（Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）檢測癌組織和癌旁組織中EPO及EPOR表達水平，利用免疫組織化學方法染色檢測微血管密度（MVD），旨在探討癌組織、癌旁組織和正常組織中EPO、EPOR及MVD的差異，分析EPO、EPOR表達水平與MVD之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

經我院倫理委員會批準同意，選取我院2016年1月—2018年3月收治的手術切除HCC的標本30例，同時取腫瘤邊緣2.0 cm的肝組織作為對照，另取10例肝外傷、肝膿腫、肝內膽管結石、肝囊腫等患者肝臟組織作為陰性對照。記錄所有患者一般資料及臨床病理資料。HCC患者中，男17例，女13例，年齡范圍27～75歲，平均年齡（45.28±9.58）歲。正常肝臟組織組患者中，男5例，女5例，年齡范圍25～72歲，平均年齡（42.11±8.67）歲。納入標準：①HCC診斷標準滿足：臨床癥狀滿足HCC診斷，并且病理結果證實為HCC。②正常肝臟診斷標準：肝臟組織病理結果證實為正常肝臟組織。③患者年齡≥18歲。排除標準：①術前接受過放化療治療者；②存在內分泌、免疫、代謝性疾病；③患者伴有其他影響研究的系統性疾病，如嚴重心臟疾病、嚴重肺部疾病、嚴重腎功能異常、其他部位腫瘤等。

1.2 觀察指標

EPO及EPOR表達水平：取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織塊，PBS沖洗后置于冰上剪碎勻漿，于4℃條件下5 000 g離心5min，留存上清液備用。利用EPO ELISA kits（上海遠慕生物科技有限公司，YM-Y11494）、EPOR ELISA kits（上海晶抗生物工程有限公司，JK-a-5635）檢測EPO及EPOR表達水平。

MVD檢測：根據Weidner［6］報道的經典MVD檢測方法進行檢測，先在低倍鏡（×100）下尋找組織中血管密度最高的4個區域，然后在高倍鏡（×400）下計數MVD，取4個象限的均值記為該組織的MVD。遇到管腔很大的特殊類型的微血管，其單位面積內的血管數相對較少，則采用由Tanigawa N［7］報道的改良法計算。

1.3 統計學方法

應用統計軟件SPSS20.0進行統計分析，對計數資料用率（%）表示，兩組比較進行c2檢驗或Fisher確切概率法檢驗，計量資料采用均數±標準差表示，正態分布且方差齊性資料比較采用t檢驗，否則采用t'檢驗，連續變量相關分析采用Person相關分析。以P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPR、EPOR、MVD在不同組織中的表達

HCC組織中，EPR、EPOR、MVD均高于癌旁組織和正常組織，差異有統計學意義（P＜0.001），EPR、EPOR、MVD在癌旁組織和正常組織中，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 HCC中EPR、EPOR、MVD與臨床病理特征間的關系

EPR、EPOR、MVD水平在HCC患者年齡、性別構成間，不存在統計學差異（P＞0.05），腫瘤大小＞5 cm、存在包膜侵犯、存在遠處轉移以及高中分化的HCC中，EPR、EPOR、MVD水平高于腫瘤大小≤5 cm、無包膜侵犯、無遠處轉移以及低分化的水平，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 EPR、EPOR、MVD在不同組織中的表達

表1 EPR、EPOR、MVD在不同組織中的表達

n HCC組織（H）癌旁組織（P）正常組織（N）30 30 10 t P EPO/（mIU·mL-1）36.67±3.28 12.13±1.68 11.22±1.90 t HvsP=36.473 t HvsN=23.149 t PvsN=1.437 PHvsP＜0.001 P HvsN＜0.001 PPvsN=0.159 EPOR/（mIU·mL-1）53.38±7.66 27.82±5.21 24.83±4.96 t HvsP=15.112 t HvsN=10.991 t PvsN=1.589 PHvsP＜0.001 P HvsN＜0.001 PPvsN=0.120 MVD/（n·mm-2）44.62±9.76 23.18±5.31 21.44±4.79 t HvsP=10.569 t HvsN=9.911 t PvsN=0.918 PHvsP＜0.001 P HvsN＜0.001 PPvsN=0.364

表2 HCC中EPR、EPOR、MVD與臨床病理特征間的關系

表2 HCC中EPR、EPOR、MVD與臨床病理特征間的關系

特征年齡（歲）＞60 n EPO/（mIU·mL-1）表達量t P EPOR/（mIU·mL-1）表達量t P MVD/（n·mm-2）密度t P 18 37.22±4.13 54.79±8.12 45.72±7.77 0.771 0.447 0.639 0.528 0.547 0.588≤60性別12 35.89±5.31 52.88±7.87 44.21±6.79男 女17 13 37.18±4.23 36.29±5.02 0.527 0.602 55.02±8.23 52.79±7.92 0.747 0.461 45.66±7.92 44.31±7.01 0.486 0.631腫瘤大小/cm＞5 11 39.28±4.33 56.72±7.93 47.97±7.33 3.055 0.005 2.175 0.038 2.311 0.028≤5包膜侵犯（+）19 34.32±4.26 50.08±8.13 41.28±7.81 11 39.35±4.28 57.29±8.05 48.14±7.51 3.337 0.002 2.737 0.011 2.715 0.011（-）遠處轉移（+）19 34.02±4.18 48.83±8.22 40.06±8.04 12 39.27±4.19 57.12±7.81 48.22±7.33 3.348 0.002 2.941 0.006 2.481 0.019（-）分化程度低分化18 34.14±4.06 48.58±7.78 41.13±7.88 13 39.77±4.71 58.93±7.89 52.28±8.83 4.215＜0.001 3.686＜0.001 5.271＜0.001高中分化17 32.25±4.94 48.53±7.48 35.57±8.43

2.3 EPO、EPOR表達水平與MVD之間的關系

Person相關分析結果顯示，EPO表達水平與MVD呈正相關，相關系數r=0.651（P＜0.001），EPOR表達水平與MVD呈正相關，相關系數r=0.620（P＜0.001）。

3 討論

EPOR是EPO的特異性膜受體，EPO可與EPOR結合，從而激活JAK/STAT、Ras/MAP等信號通路［8-9］。而這些信號通路又與眾多腫瘤的發生發展有著密切的關系［10］。目前研究表明，EPO作為一種內源性促血管生成因子與EPOR結合，參與了多種人類惡性腫瘤的發生發展。腫瘤微血管形成是腫瘤建立血液循環的過程。MVD可直接反應腫瘤微血管形成的水平，常作為反映腫瘤血管生成的代表性指標之一，不僅能夠反映腫瘤的供氧，也可間接反映腫瘤的轉移和浸潤能力［10-11］。HCC是典型的多血管腫瘤，MVD水平的檢測具有重要的意義。基于以上，本研究通過分析EPO、EPOR在NCC中的表達規律，以及它們和MVD之間的關系，擬為進一步闡明HCC微血管發生的機制提供理論依據。

本研究發現，HCC組織中，EPO、EPOR、MVD均高于癌旁組織和正常組織，而在癌旁組織和正常組織中，盡管癌旁組織EPO、EPOR、MVD水平高于正常組織，但無統計學意義。這一結果與以往Qu Z［12］的研究結果相一致。EPO在由HCC細胞分泌后，可通過自分泌或者旁分泌的方式與EPOR相結合，最終作用于HCC血管內皮細胞，發揮促進HCC微血管形成的作用［13］。而在癌旁組織或正常組織中，由于缺少HCC細胞的分泌作用，EPO、EPOR表達呈低水平，減少了MVD的數量。

為了進一步探討HCC組織中，EPO、EPOR、MVD與腫瘤病理學特征之間的關系，本研究按不同年齡組、性別、腫瘤大小、有無包膜侵犯、有無遠處轉移及分化程度將樣本進行分組比較。結果發現，腫瘤大小＞5 cm、存在包膜侵犯、存在遠處轉移以及高中分化的HCC中，EPR、EPOR、MVD水平明顯高于相對應的分組。這說明，EPR、EPOR、MVD與HCC病理學特征密切相關，EPR、EPOR、MVD高的患者，其腫瘤較大，存在包膜侵犯和遠處轉移，惡性程度也較高。提示，它們在HCC的發生發展、侵襲轉移過程中起著重要的作用。

為了探討EPR、EPOR是否與MVD之間存在關系，本研究利用Person相關分析分析了EPO、EPOR表達水平與MVD之間的關系。結果發現，EPO表達水平、EPOR表達水平分別與MVD的呈正相關。提示EPO、EPOR可能通過直接或間接途徑增加MVD。

綜上所述，盡管本研究初步證實了EPO、EPOR、MVD在HCC中呈現高水平，且與腫瘤大小、局部侵犯、遠處轉移及分化程度有關，其機制可能與EPO、EPOR增加MVD有關。但由于納入研究的樣本量較少，可能使結果產生偏倚，在今后的研究中，應擴大樣本量，增加EPO、EPOR、MVD對患者無瘤生存期的影響，以進一步探索EPO、EPOR、MVD與HCC腫瘤生長的機制。