苦蕎黃酮提取方法的研究及含量測(cè)定分析

孫亞利，周文美＊，趙天明，李向東，王小平

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院 發(fā)酵工程與生物制藥省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽 550025；3.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴陽 550025）

苦蕎麥，別名菠麥、花蕎等，起源于我國(guó)西南部，栽培于我國(guó)東北、內(nèi)蒙、河北、山西、陜西、甘肅、青海、四川、云南等地，亞洲、歐洲和北美也有栽培［1，2］。

苦蕎麥有“五谷之王”的美稱，是藥食兩用的良藥佳肴?！侗静菥V目》記載：“苦蕎味苦，性平寒，能實(shí)腸胃，益氣力，續(xù)精神，利耳目，煉五臟渣穢”［3］?？嗍w麥富含黃酮、氨基酸、膳食纖維、多糖、多酚等活性成分，其中黃酮類化合物具有顯著的抗氧化功效，可以防治多種慢性疾病，在食品加工中廣泛用于各種糕點(diǎn)、調(diào)味食品、保健食品等的生產(chǎn)，深受人們的喜愛［4－8］。

閆斐艷［9］、王廷璞等［10］、李朋等［11］曾分別采用熱水浸提、乙醇提取、索氏提取等方法對(duì)苦蕎總黃酮含量進(jìn)行了探究，綜合分析可得：熱水浸提法得率最低，為0.44%，且產(chǎn)物純度低，不易保存；乙醇提取法耗時(shí)太長(zhǎng)，不利于高效作業(yè)；索氏提取法最優(yōu)提取率為1.462%，但其適用規(guī)模太小，無法投入生產(chǎn)，相比而言，超聲和微波提取法利用機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和電磁場(chǎng)作用［12，13］，可有效輔助乙醇浸提法，實(shí)現(xiàn)生物有效成分的快速分離。本實(shí)驗(yàn)以貴州苦蕎為研究對(duì)象，對(duì)超聲波和微波輔助醇提法提取苦蕎麥總黃酮的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，探討了苦蕎麥中黃酮類化合物的提取和測(cè)定方法，以期為苦蕎麥黃酮類化合物的進(jìn)一步研究、開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦蕎麥：2017年9月采集于貴州省貴陽市白云區(qū)；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；無水乙醇、三氯化鋁、乙酸鉀（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇、磷酸（均為色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。

101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HC-280T2高速多功能粉碎機(jī) 永康市綠可食品機(jī)械有限公司；PS-100A超聲波清洗器 東莞市潔康超聲設(shè)備有限公司；ORW2S-5H微波設(shè)備 南京澳潤(rùn)微波科技有限公司；島津UV-2550紫外可見分光光度計(jì) 廈門儀宸科技有限公司；Agilent 1260 Infinity LC高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按李欣等的AlCl3法［14］，測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)、蕓香苷質(zhì)量濃度（mg／mL）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y＝0.0292x＋1.2738E-5，r＝0.99956。

1.2.2 苦蕎麥中總黃酮的制備

樣品的前處理：將苦蕎麥置于45℃烘箱中，烘干過夜，取出適量于粉碎機(jī)中粉碎，過100目篩，放入自封袋中，備用。

超聲提取法：準(zhǔn)確稱取1g苦蕎麥粉末，與一定量乙醇混合，在不同提取溫度下，超聲波功率500W，持續(xù)一段時(shí)間后；4℃、5000r／min離心15min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾得到總黃酮提取液。

微波提取法：準(zhǔn)確稱取1g苦蕎麥粉末，與一定量乙醇混合，微波功率300W，持續(xù)一段時(shí)間后；4℃、5000r／min離心15min，取上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾得到總黃酮提取液。

在較低溫度超聲提取時(shí)，應(yīng)注意循環(huán)換水，以防因機(jī)器工作造成溫度升高；微波提取時(shí)，要注意調(diào)節(jié)冷凝水的流速，防止提取液噴出；應(yīng)小心緩慢取出離心管中上清液，避免有沉淀倒出。

1.2.3 苦蕎麥中總黃酮含量的測(cè)定

取1mL樣品待測(cè)液于10mL容量瓶中，用AlCl3法測(cè)其吸光度，計(jì)算苦蕎麥中總黃酮的含量。根據(jù)回歸方程求得相應(yīng)苦蕎黃酮濃度，按下式計(jì)算總黃酮得率：

1.2.4 HPLC色譜條件［15－19］

色譜柱：Agilent TC C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.3%磷酸溶液（47∶53，V／V）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：257nm；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣量：10μL。重復(fù)6次。

1.2.5 苦蕎蕓香苷HPLC分析

蕓香苷對(duì)照品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取蕓香苷0.010g，用色譜級(jí)甲醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，制成1mg／mL蕓香苷對(duì)照品貯備液。準(zhǔn)確稱取苦蕎麥粉1g，根據(jù)1.2.2待測(cè)液的制備方法處理，離心，取1.5mL上清液，0.22μm濾膜過濾備用。本實(shí)驗(yàn)于2018年5月～6月，分別在貴州大學(xué)和貴陽理工學(xué)院完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察了乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、微波時(shí)間及超聲溫度對(duì)苦蕎黃酮得率的影響，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，確定超聲波輔助醇提法和微波輔助醇提法的最佳工藝參數(shù)，并對(duì)這2種方法進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎總黃酮得率的影響

圖1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苦蕎黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol mass fraction on the yield of tartary buckwheat flavonoids

由圖1可知，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，苦蕎總黃酮得率先增加后減少，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%和50%時(shí)，超聲、微波提取總黃酮得率最高，繼續(xù)增加乙醇濃度，總黃酮得率下降，可能是其他醇溶性雜質(zhì)、色素等溶出，造成黃酮溶解度降低，得率減?。?0］。故超聲提取、微波提取的最佳乙醇濃度分別為60%和50%。

2.1.2 料液比對(duì)苦蕎總黃酮得率的影響

圖2 料液比對(duì)苦蕎總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on the yield of total flavonoids in tartary buckwheat

由圖2可知，隨著料液比的減小，總黃酮得率先增加后減少；當(dāng)料液比達(dá)到1∶30時(shí)，總黃酮得率最高，其主要原因可能是料液比大時(shí)不能使苦蕎黃酮充分溶解，料液比小時(shí)苦蕎黃酮濃度過小，進(jìn)而影響總黃酮得率。綜上，在超聲提取和微波提取實(shí)驗(yàn)中，最佳料液比均為1∶30。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)苦蕎總黃酮得率的影響

圖3 超聲時(shí)間和微波時(shí)間對(duì)苦蕎總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time and microwave time on the yield of total flavonoids in tartary buckwheat

由圖3可知，隨著提取時(shí)間增加，總黃酮得率先增加后減少；當(dāng)超聲時(shí)間、微波時(shí)間分別為40，2min時(shí)，總黃酮得率最高；繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間不利于得率的提升。可能是由于提取時(shí)間增加，熱量聚集，造成黃酮結(jié)構(gòu)改變，得率減小。綜上，確定超聲、微波提取最佳時(shí)間分別為40min和2min。

2.1.4 超聲溫度對(duì)苦蕎總黃酮得率的影響

圖4 溫度對(duì)苦蕎總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of total flavonoids in tartary buckwheat

由圖4可知，提取溫度在40℃內(nèi)，苦蕎黃酮溶解度隨溫度的升高而增大；超過40℃后，黃酮得率變化不顯著（p＞0.05），這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度過高時(shí)，蛋白質(zhì)析出，造成黏度增大，進(jìn)而影響了黃酮物質(zhì)的析出。因此選擇40℃為最佳超聲提取溫度。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲波輔助醇提法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、溫度、時(shí)間4個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)考察各因素對(duì)苦蕎黃酮提取效果的影響，確定超聲提取的最佳工藝，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 超聲提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table1 Ultrasonic extraction orthogonal test results

表2 超聲提取正交試驗(yàn)方差分析Table2 Analysis of variance of ultrasonic extraction orthogonal test

由表1和表2可知，4個(gè)因素均對(duì)總黃酮得率有極顯著影響，各因素對(duì)總黃酮得率影響的程度為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度，超聲提取的最優(yōu)，工藝為A3B2C2D1，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶30，提取時(shí)間為30min，提取溫度為40℃，平均得率為2.35%。

2.2.2 微波輔助醇提法

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、時(shí)間3個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)考察各因素對(duì)苦蕎黃酮提取效果的影響，確定微波提取的最佳工藝，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

銀行貸款方面，雖然目前我國(guó)很多銀行都有了自己的小額信貸部門，但從小微企業(yè)通過銀行貸款融資的過程和結(jié)果看，依然很受“歧視”。原因包括：

表3 微波提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table3 Microwave extraction orthogonal test results

表4 微波提取正交試驗(yàn)方差分析Table4 Analysis of variance of microwave extraction orthogonal test

由表3和表4可知，3個(gè)因素均對(duì)總黃酮得率有極顯著影響，影響程度為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比，微波提取最優(yōu)工藝為A3B3C1，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，提取時(shí)間為1min，料液比為1∶40，平均得率為2.47%。

通過正交試驗(yàn)結(jié)果分析可得，微波提取總量高于超聲提取，且差異顯著（p＜0.05），而且微波提取大大節(jié)省了時(shí)間。

2.3 苦蕎總黃酮含量的測(cè)定

2.3.1 精密度試驗(yàn)

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，按1.2.3節(jié)測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，得精密度為1.13%，精密度試驗(yàn)符合要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，按1.2.3節(jié)分別于15，30，45，60，75，90min測(cè)定吸光度，結(jié)果見表5。

表5 總黃酮穩(wěn)定性試驗(yàn)Table5 The stability test of total flavonoids

超聲提取與微波提取的RSD分別為0.73%和0.97%，即2種提取法在90min內(nèi)總黃酮量基本不變，穩(wěn)定性良好，符合試驗(yàn)要求。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，按1.2.3節(jié)測(cè)定吸光度，結(jié)果見表6。

表6 總黃酮重現(xiàn)性試驗(yàn)Table6 The reproducibility test of total flavonoids

超聲提取與微波提取的RSD分別為1.31%和1.46%，重現(xiàn)性良好，符合試驗(yàn)要求。

2.3.4 回收率試驗(yàn)

精確稱取苦蕎麥粉1.0g，用于超聲提取和微波提取的樣品中分別加入40mL乙醇和1mL蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液（質(zhì)量濃度為1.6mg／mL）。按上述超聲提取和微波提取的最優(yōu)工藝條件制備各樣品溶液，重復(fù)5次，計(jì)算總黃酮得率，確定回收率，結(jié)果見表7。平均回收率分別為103.06%和101.11%，符合試驗(yàn)要求，兩者回收率差異不顯著（p＞0.05）。

表7 總黃酮回收率Table7 The recovery of total flavonoids

續(xù) 表

2.4 蕓香苷的HPLC含量測(cè)定結(jié)果

2.4.1 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以蕓香苷進(jìn)樣量（μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y＝1607.32848x－1.0414，r＝0.99998，蕓香苷含量在1～20μg／mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，見圖5和圖6。

圖5 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.5 Chromatogram of rutin standard

圖6 樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of the sample

2.4.2 精密度試驗(yàn)

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按1.2.4節(jié)測(cè)定蕓香苷含量，得精密度為1.05%，精密度良好，符合試驗(yàn)要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，每隔1h進(jìn)樣10μL，按1.2.4節(jié)測(cè)定蕓香苷含量，結(jié)果見表8。超聲提取與微波提取的RSD分別為1.32%和1.31%。即2種提取法在6h內(nèi)蕓香苷含量基本不變，穩(wěn)定性良好，符合試驗(yàn)要求。

表8 蕓香苷穩(wěn)定性試驗(yàn)Table8 The stability test of rutin

2.4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

按1.2.2節(jié)制備苦蕎黃酮樣品液，平行6次，按1.2.4節(jié)測(cè)定蕓香苷含量，結(jié)果見表9。超聲提取與微波提取蕓香苷含量分別為1.141%和1.193%，RSD分別為1.43%和1.13%，重現(xiàn)性良好，符合試驗(yàn)要求。

表9 蕓香苷重現(xiàn)性試驗(yàn)Table9 The reproducibility test of rutin%

2.4.5 回收率試驗(yàn)

按2.4.4節(jié)制備回收率試驗(yàn)樣品，依據(jù)1.2.4節(jié)測(cè)定蕓香苷含量，確定回收率，結(jié)果見表10。平均回收率分別為103.61%和100.16%，兩者回收率接近，微波的效果略好于超聲波，且差異顯著（p＜0.05）。

表10 蕓香苷回收率Table10 The recovery of rutin

3 結(jié)論

由正交結(jié)果及方差分析可知，超聲提取苦蕎總黃酮的最優(yōu)工藝為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶30、提取時(shí)間30min、提取溫度40℃，影響程度為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度，4個(gè)因素均對(duì)總黃酮得率有極顯著影響。微波提取最優(yōu)參數(shù)為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間1min、料液比1∶40，影響主次為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比，均對(duì)總黃酮得率有極顯著影響。

超聲波輔助醇提法與微波輔助醇提法相比，微波提取黃酮得率更高，而且微波輔助醇提法 大大減少了生產(chǎn)周期，提高了產(chǎn)品得率。

采用HPLC法測(cè)定苦蕎蕓香苷含量，結(jié)果表明：超聲提取蕓香苷含量為1.141%，微波提取蕓香苷含量為1.193%。微波提取效果優(yōu)于超聲提取，差異顯著（p＜0.05）。