外泌體在胰腺癌診療中的臨床意義

鄭杰，單云峰

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000，1.介入科，2.肝膽外科）

胰腺癌是全球最致命的癌癥之一，其中胰腺導管腺癌（PDAC）占胰腺癌的80%[1]。盡管在過去的30年間胰腺癌的診斷檢測與治療取得了進展，但五年生存率僅為8%[2]。這種低生存率主要歸因于胰腺癌診斷時常為晚期，有高轉移潛力，治療選擇有限，目前的常規療法效果不佳[3-4]。手術切除腫瘤仍然是這些患者實現長期生存的唯一希望，但由于PDAC患者在診斷時常為晚期，僅20%的胰腺癌患者可進行根治性切除[4]。此外，手術切除的患者仍有高比例的復發風險，通常在2年內死亡[5]。

外泌體是內吞起源的細胞外囊泡（EV），其大小約30～150 nm[6]。外泌體可由細胞分泌到細胞外間隙并進入血液循環，并可攜帶反映其源細胞特征的蛋白質、核酸和脂質組等，參與調節細胞間的通訊與行為[7-8]。其中，癌細胞來源的外泌體參與腫瘤微環境的形成，是癌癥發生發展的重要因素[8-11]，近年來已成為研究人類癌癥的診斷生物標志物和治療靶標的熱點之一[12]。胰腺癌細胞來源的外泌體（PEX）是胰腺癌的腫瘤發生發展的關鍵因素之一[13]。本文就外泌體對胰腺癌的診斷、治療及預后檢測的臨床價值進行討論。

1 PEX與胰腺癌的診斷

由于胰腺癌潛在發病且缺乏特異的臨床表現，大多數患者診斷時往往是晚期[14]。傳統的影像學檢查，如CT/MRI掃描和內鏡逆行胰膽管造影（ERCP）價格昂貴，并且可能存在潛在的誘發風險[15]。CA19-9是目前唯一被批準用于胰腺癌診斷的血清生物標志物，但CA19-9缺乏敏感性和特異性，約25%的患者不升高，且慢性胰腺炎（CP）和高膽紅素血癥患者的CA19-9水平也會增加[16]。而外泌體由于其生物學特性，在臨床診斷方面具有獨特優勢。首先，胰腺癌細胞產生的囊泡主要是PEX而不是其他細胞外囊泡，PEX內富含大量具有檢測價值的標志物[7]；第二，PEX可以從多種體液中非侵入性地收集，并且可以實時監測[12]；第三，PEX具有穩定性，其內容物不受外部核酸酶和蛋白酶的降解[12]；第四，與常規活組織檢查相比，PEX分子可以通過RT-PCR和新一代測序檢測，相對便捷[15]。

PEX中異常表達的生物分子具有一定的診斷價值。研究報道，胰腺癌來源的外泌體膜中富含一種名為磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（GPC1）的蛋白質，它是多種癌癥類型中過表達的膜錨定蛋白[17]，通過啟動子的低甲基化在胰腺癌患者中高表達[18]。Melo等[13]研究發現，來自190例PDAC患者的外泌體檢測出比健康個體中更高水平的GPC1，對于早期診斷的胰腺癌同時具有100%的敏感性和100%的特異性，并且GPC1陽性PEX的水平可區分I～IV期胰腺癌患者。Yang等[19]建立了包含5種基于EV的蛋白質標志物（EGRF、EPCAM、MUC1、GPC1和WNT2）的聯合模型，結果顯示其比現有血清標志物CA19-9或任何單一EV標志物具有更高的靈敏度（86%）和特異性（81%），其中包括最佳標志物GPC1的靈敏度（82%）和特異性（52%）。這兩項研究中GPC1的抗體及囊泡分離方法可能導致其結果差異，但進一步表明GPC1可能是胰腺癌中有效的早期篩選生物標志物。此外，PC-1.0細胞（一種高度惡性的胰腺癌細胞系）來源的外泌體內含有鋅轉運蛋白（ZIP4），能夠有效區分胰腺癌和良性胰腺疾病、膽道疾病和正常對照，并且ZIP4能夠在體外和體內促進PC-1.0癌細胞進展，提示ZIP4可能是胰腺癌的新型診斷生物標志物[20]。

此外，許多研究表明PEX中富含的多種miRNA具有潛在的診斷價值。Lai等[14]的研究表明，高PEX-miR-10b、-miR-21、-miR-30c和-miR-181a以及低PEX-miR-let7a水平能夠顯著區分早期PDAC與正常組織；另外某些升高的miRNA在PDAC切除術后24 h內降至正常值，表明PEX-miRNA的診斷價值可能優于GPC1。另外，有研究對15例早期胰腺癌及正常組織進行新一代測序，結果發現PEX中高度富集的miR-196a和miR-1246可能是早期檢測胰腺癌的潛在生物標志物，其中miR-1246更適用于導管內乳頭狀黏液性腫瘤（IPMN）[21]。此外，PEX-miR-191、-miR-21和-miR-451a在胰腺癌和IPMN中也顯著過表達，其診斷準確度比相應的循環miRNA高5%～20%[22]，其中miR-21還可能與胰腺癌預后有關。另外一項研究證實，PEX中高表達的miR-17-5p和miR-21能靈敏地區分胰腺癌與良性胰腺腫瘤，并且PEX-miR-17-5p可能參與胰腺癌進展[23]。值得注意的是，該研究結果表明PEX中miR-196a較正常U6內參低表達，這與之前一項研究結果不一致。綜上，PEX-miRNA在早期診斷方面具有一定的優勢，可用于胰腺癌的篩查。目前已有研究團隊開發了DSN輔助的雙SERS生物傳感器，用于外泌體中的microRNA-10b和基于Fe3O4@Ag-DNA-Au@Ag@DTNB綴合物的血液樣品檢測的殘留血漿的檢測，對來自PDAC、CP和正常對照的血液樣品中的靶miRNA和血液樣品的殘留上清液直接定量，并且在它們之間可以發現顯著的SERS信號區別，以此來精確反映PEX-miRNA，希望實現癌癥一步法診斷的即時診斷技術[24]。此外，Nakamura等[25]檢測收集27個PDAC與8個慢性胰腺炎的胰液樣本，發現PDAC患者中的PEX-miR-21與-miR-155顯著高于CP患者，聯合胰液細胞學的診斷準確度可達91%，證實胰液中的PEX-miRNA也可作為PDAC的生物標志物。

2 PEX與胰腺癌的治療

外泌體中攜帶含有許多生物學功能的小分子物質，同時具備了多種理想材料的特性，使得PEX能夠成為胰腺癌的重要治療靶點。腫瘤來源外泌體可以傳遞這些“關鍵分子”到腫瘤細胞中，對腫瘤細胞的存活和生長具有促進作用，這意味著抑制外泌體生成、釋放或攝取的藥物可能具有治療癌癥的潛能。同時PEX也非常穩定，可以長期儲存，適合工業生產。此外，PEX還可以作為“微型抗原呈遞細胞”，參與促進宿主組織侵入和隨后的免疫應答的轉移和逃避過程，具有作為新型免疫治療劑的應用潛能[26]。本文主要闡述外泌體抑制劑的抗腫瘤作用以及PEX在免疫療法方面的研究進展。

目前，關于在PDAC免疫療法中使用PEX的研究仍然很少。最近的一項體內研究表明，常用于PDAC治療的化療藥物（即全反式維甲-ATRA、舒尼替尼和吉西他濱）與負載PEX的樹突狀細胞（DC）疫苗相結合，可有效抑制轉移瘤的生長，延長胰腺癌小鼠的存活時間[27]。Su等[28]用轉染miR-155和miR-125b2的Panc-1細胞外泌體處理，可將M2巨噬細胞重新編程為具有抗腫瘤表型的M1型。因此，應進一步探索生物工程腫瘤外泌體，以表達可導致巨噬細胞表型變化并抑制其免疫抑制和促腫瘤活性的特異性miRNA用于臨床研究。另一項研究表明，巨噬細胞來源的外泌體能夠在體外和體內顯著降低PDAC細胞對吉西他濱的敏感性，用吉西他濱治療后，Rab27a和Rab27b敲除的小鼠PDAC腫瘤比野生型小鼠更小[29]。盡管該研究的重點不是基于PEX的免疫治療，但從另一方面表明PEX介導的胰腺癌細胞和免疫細胞之間的細胞間交流可能是導致胰腺癌的預后不良和治療抵抗的關鍵因素。同時該研究還表明，化療藥物與Rab27a/b抑制劑或其他外泌體分泌抑制劑的組合可以顯著改善患者對胰腺癌的療效反應。Zech等[30]報道，來自大鼠胰腺癌細胞系BSp73ASML（ASML）的外泌體可通過減少CD44v6、ZAP70和ERK1/2磷酸化來影響白細胞增殖。此外，胰腺癌衍生的PEX通過miR-203下調樹突狀細胞中的TLR4和下游細胞因子[31]。另外一些研究報道了腫瘤衍生的納米顆粒對腫瘤細胞可能具有凋亡作用。人胰腺腫瘤衍生的納米顆粒能夠抵消組成型活化的PI3K/AKT存活途徑，誘導腫瘤細胞凋亡[32]。而腫瘤外泌體納米顆粒能夠通過與靶細胞的相互作用抑制Notch-1的細胞存活途徑，并激活決定腫瘤細胞命運的細胞凋亡途徑[33]。

此外，還可以通過抑制癌癥來源的外泌體的分泌來觸發抗癌免疫應答，從而阻礙癌細胞重編程其微環境能力。吉西他濱與外泌體抑制劑GW4869的聯用可以用于預防化療耐藥[34]。但GW4869會同時抑制癌細胞和正常細胞分泌的外泌體，直接抑制外泌體分泌可能會導致正常的細胞功能喪失，因此應慎重選擇其適應證。目前相對安全的方法是抑制已知能夠實現外泌體的促腫瘤發生和促轉移功能的特定蛋白質。例如，有研究發現GAIP-相互作用蛋白C末端（GIPC）是阻斷腫瘤細胞自噬的主要調節因子，它通過影響PEXs的生物發生、分泌和分子組成來調節細胞運輸途徑[35]。另外，GIPC能夠耗竭PEX中的抗藥性基因ABCG2（一種抗藥性蛋白）的過表達，使得腫瘤細胞吉西他濱仍然敏感。因此，GIPC可能是克服胰腺癌化療耐藥的潛在治療靶點。Hoshino等[9]發現，在PEX中對過表達的ITG4或ITG5的抑制能夠顯著降低胰腺癌細胞遠處轉移的能力。此外，其他細胞囊泡運輸蛋白也可能在臨床治療中作為靶點，如RAB27A與TP53與胰腺癌的侵襲行為有關[36-37]。另一方面，如果癌癥來源的外泌體的特異性靶向成為現實，那么可能會出現一系列新的治療可能性，從而有可能徹底改變癌癥治療的方式。最近，Datta等[38]通過定量高通量篩選（qHTS）對LOPAC文庫和NPC文庫兩種藥物庫進行篩選，從中篩選鑒定出能夠調節前列腺癌細胞外泌體生物發生和分泌能力的化合物，該研究表明藥物再利用可通過影響外泌體而作為晚期癌癥的新型輔助治療策略。

3 PEX與胰腺癌的預后、轉移和復發

關于PEX在胰腺癌預后中的作用尚未進行確定的臨床研究，但已經有一些研究報道了PEX在胰腺癌中的預后價值。例如PEX-GPC1與術前和術后患者的腫瘤負荷及生存相關，提示其作為胰腺癌預后生物標志物的作用[13]。而胰腺癌中高表達的RAB27A與TP53與預后差有關[37]。PEX-miR-17-5p預測胰腺癌患者預后不良，因為它與炎癥反應或腫瘤免疫逃逸有關[23]。MiR-21是另一種PEX miRNA，已被確定為胰腺癌總體存活的候選預后因子[22]。MiR-301a-3p在缺氧條件下選擇性包裝入PEXs，與浸潤深度、淋巴結轉移和晚期TNM分期呈正相關，因此是胰腺癌的預后分子[39]。此外，具有腫瘤前胰腺病變的小鼠和患有I期PDAC的患者高度表達PEXMIF，表明PEX-MIF在肝轉移之前是可檢測的，因此可能具有預后價值。PEX中的DNA也可能具有預后意義，PEX突變體KRAS的縱向監測可以預測局部胰腺癌患者的新輔助治療結果和轉移瘤患者的進展[40]。因此，PEX內容物在預后價值中的判斷值得進一步臨床研究。

外泌體可以作為介導鄰近或長距離細胞間的通訊交流信號，具有符合癌癥轉移的潛在條件因素[9]。Gesierich等[41]在大鼠胰腺癌研究中發現癌細胞可以大量傳遞外泌體，這些外泌體起到長距離細胞間通訊的作用，并且是形成轉移前生態位的主要成分。另一項研究也表明外泌體在突變CD44介導的轉移前生態位形成中起重要作用[42]。最近的一項研究也表明PDAC衍生的外泌體在幼稚小鼠中誘導肝臟轉移前的生態位，并增加肝臟轉移負荷[10]，該研究還報道巨噬細胞移動抑制因子（MIF）在PDAC衍生的外泌體中高度表達。與胰腺腫瘤無進展的患者相比，I期PDAC發生肝轉移的患者外泌體水平顯著升高。這些研究結果表明，MIF外泌體水平可作為肝臟轉移前生態位形成的早期生物標志物，也可作為腫瘤前病變患者轉移風險的預后因素，如胰腺炎、IPMNs和轉移前PDAC[10]。總之，研究表明腫瘤來源的外泌體可能參與原發性腫瘤細胞器官特異性轉移，但仍需要進一步的研究來確定抑制外泌體功能對轉移前的生態位形成及其在胰腺癌中的治療潛力的影響。

4 外泌體作為給藥載體

外泌體可作為腫瘤特異性抗原和免疫調節藥物的納米載體，是有希望治療癌癥的方法之一。外泌體與其他納米粒子相比具有多種優勢，如其本身的內源性特性，并能攜帶不同類型分子（包括蛋白質、脂質和核酸）的能力[43-44]，同時具備無毒性和非免疫原性。目前應用的納米載體如脂質體，實際上是基于脂質的納米載體，脂質體的合成性質和聚合物核心決定了其固有的相關毒性[45-46]。因此，脂質體被普遍認為是外來的，且可引發過敏反應，其特征在于強烈的先天免疫反應[47]。與脂質體不同，外泌體由生物體內的大多數細胞自然分泌[6]，探索患者自身的健康細胞來生產用于癌癥治療的外泌體，可以減少對受體的不良免疫反應[48]。已有研究報道，CD47能夠保護小鼠的循環中的外泌體免受單核細胞和巨噬細胞的吞噬作用，依賴這種保護作用，外泌體能夠將體內靶向KRASG12D的RNAi分子遞送至胰腺癌細胞，并顯著提高胰腺癌小鼠存活率，其療效遠高于脂質體[49]。外泌體還可以增強其內容物（特別是RNA分子）的穩定性和生物利用度，避免這些載物在通過循環時被迅速降解[50-51]。另一方面，外泌體的小尺寸使它們能夠穿透天然屏障，包括血腦屏障[52-53]，并深入到組織內[54]。外泌體能夠被特定的靶細胞吸收，這一過程可能受外泌體表面特異性黏附分子、整合素和四跨膜蛋白的調節[55-57]。例如，表達Tspan8的細胞的外泌體優先被CD54+的胰腺細胞和內皮細胞攝取[57]。因此，未來基于外泌體的療法可以利用這些特征來靶向特定細胞。但這一特性也表明，不應輕率使用外泌體作為免疫調節藥物的載體。外泌體表面蛋白的微小變化可以改變外泌體的特異性，對外泌體生物產生過程及對靶細胞廣泛了解是研究基于外泌體的治療工程所具備的基本要求[57]。外泌體表面特定蛋白的表達可以通過上調源細胞中相關蛋白表達來控制[57-58]。將超順磁性納米顆粒錨定到外泌體上可以改善腫瘤細胞的靶向性，外泌體可通過中等磁場“引導”到腫瘤細胞中[59]。進入受體細胞后，外泌體將內容物釋放到細胞質中，誘導蛋白質表達[60-61]、信號通路的激活狀態[62]和細胞的表型[63-65]等變化。此外，外泌體也可以通過內吞作用進入受體細胞，或通過外泌體膜中存在的蛋白質與受體細胞的質膜融合[43]。因此，外泌體是將免疫調節劑遞送到特定靶細胞中以阻斷免疫抑制和（或）刺激抗癌免疫應答的潛在工具。這兩種方法可以與標準化療藥物聯合使用，以最大限度地消除胰腺癌細胞，減小副作用，從而達到手術能夠切除腫瘤的目的，提高患者的存活率。

5 目前的局限性和未來的展望

據我們所知，目前在胰腺癌的研究領域，尚未有研究或課題使用外泌體來作為提供免疫治療藥物、抗原、細胞因子或其他免疫刺激分子。基于PEX的多種功能和臨床意義，PEX是有潛力的生物標志物和胰腺癌治療的潛在靶標。許多標志物分子的不同表達賦予PEXs診斷和預后價值。通過細胞間通訊，PEX參與腫瘤細胞的增殖和凋亡，免疫耐受和轉移，以及代謝重編程，為胰腺癌提供了各種潛在的治療靶點。許多研究也證明外泌體分泌的抑制對治療癌癥有效[11，34]。此外，外泌體可能是一種新型的藥物遞送工具，因為與常規納米顆粒相比，它具有多種獨特的性質。然而，在考慮PEX的臨床應用之前，需要解決幾個問題。首先，由于缺乏標準化方案，很難比較PEX相關研究中的結果。因此需要建立一套無爭議的程序，包括開始樣品量、外泌體富集、內容物提取和純化，以及選擇合適的內參對照[11]。其次，PEX的影響取決于其內容物：PEX中既有促癌相關分子，也有抑癌相關分子[66]。評價衡量這種腫瘤負荷平衡也是亟需解決的關鍵問題。第三，大多數PEX相關研究是在體外進行的，今后的研究應當在這些體外培養體系中使用外泌體制劑來探討外泌體對細胞的影響，但在這種條件下分泌的外泌體內容物的數量是否會受到影響我們不得而知。第四，當研究體內PEX的功能時，重要的是實現PEX釋放的特異性誘導或干擾而不影響EV或其他信號分子的其他亞型的釋放。第五，盡管許多PEX內容物是胰腺癌的生物標志物候選者，但目前尚未應用到臨床。因此對這些候選基因進行基礎研究向臨床實踐的轉化驗證也是必不可少的。第六，對血漿和血清以外的生物流體的關注有限。一項研究表明，唾液外泌體是比血清外泌體更好的診斷候選者[67]，這表明在未來的研究中需要更多地關注非常規生物流體。最后，對于外泌體作為胰腺癌的藥物遞送系統，必須開發適當的方法來改善藥物包封、器官向性和外泌體的耐久性。顯然，對PEX的研究還處于起步階段。鑒于PEX的臨床意義和該研究領域的挑戰，需要更多的努力來深入了解PEX，以促進胰腺癌的治療和預后。此外，獲得用于治療目的的外泌體的最佳細胞來源仍有爭議。我們提倡使用從患者自身分離的健康細胞來獲得外泌體，然后可以將其設計為將免疫調節分子攜帶至特定細胞。結果表明，這些囊泡能夠逃避免疫系統并安全地穿過血流以激活針對癌細胞的特異性免疫應答。目前牛乳外泌體由于易分離、易大規模生產和缺乏免疫原性，可作為解決難題的方案之一[68-69]。我們希望今后的研究能夠更好地了解使用外泌體的治療方法的益處和風險，并找到克服目前面臨的挑戰的新方法。