調節性T細胞在角膜移植排斥反應中的研究進展

邊 江，王 婷,史偉云，阮慶國

0引言

自1905年奧地利眼科醫師Eduard Konrad Zirm成功施行首例人類同種異體穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty，PKP)以來[1]，角膜移植技術飛速發展，已成為治療終末角膜疾病的理想方式。龐大的角膜病患者群體和較高的移植成功率使角膜移植在器官及組織移植領域占據著獨特并重要的地位。相比其它組織器官，雖然角膜移植術成功幾率相對較高，但術后排斥反應仍然是手術失敗的主要原因。受體角膜植床的微環境，如炎癥刺激、血管化，以及多次角膜移植史等，都成為導致角膜移植排斥的危險因素，術后排斥幾率達到50%[1-2]。隨著角膜移植手術方式的不斷創新、改進，板層角膜移植術(lamellar keratoplasty，LKP)、角膜內皮移植術(endothelial keratoplasty，EK)等替代了一部分全層角膜移植[3-4]；國內外新型免疫抑制劑等抗排斥藥物的研發及使用，在一定程度上提高了高危角膜移植的成功幾率[5-7]。然而，目前對角膜移植術后免疫排斥反應的發生機制仍然沒有明確的解釋，即使積極使用抗排斥藥物干預，臨床上仍可見大量移植后排斥病例。

角膜以它獨特的無血管、無淋巴管的解剖結構，以及前房生理特點，成為人體少有的免疫赦免組織[1, 8]。但當受炎癥刺激或新生血管化等因素的影響后，免疫赦免遭到破壞，繼而針對異體抗原發生宿主免疫應答。當發生免疫排斥反應后，機體進行一系列免疫調節，免疫細胞與免疫分子相互作用，使免疫應答以最恰當的形式維持在合適的水平，維持機體內環境平衡穩定，誘導免疫耐受。體內外實驗表明，調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)在免疫調節中起著關鍵性作用[9-12]，是自身免疫性疾病、腫瘤、器官移植排斥反應相關領域研究的熱點。本篇綜述主要介紹調節性T細胞參與眼部免疫耐受的相關內容，著重闡述調節性T細胞在角膜移植排斥過程中的作用、機制和應用。

1 Treg細胞誘導眼部免疫耐受

眼睛是人體重要的感受器官，當接受外界抗原或移植物后可以長期存活，被稱為免疫赦免器官。早期研究認為，眼部的淋巴系統主要存在于淚腺和結膜組織中，這種無血管、無淋巴管的特殊解剖結構是前房具有免疫赦免特性的主要機制[8]。但隨著研究的不斷進展，逐漸發現除了特殊的解剖結構外，免疫調節機制在維持眼免疫赦免狀態中也發揮了重要的作用。免疫調節的核心是抑制效應T細胞產生炎性因子及1型輔助性T(Th1)細胞引起的遲發型免疫反應(delayed-type hypersensitivity，DTH)。調節性T細胞是維持免疫耐受狀態的關鍵因素，其主要機制是通過細胞表面分子與其他淋巴細胞相應配體結合，以細胞-細胞接觸依賴的方式，發揮抑制效應細胞增殖和分化的作用；或者通過分泌免疫抑制性細胞因子，如TGF-β、IL-10來間接發揮抑制作用[13-15]。

1.1眼部Treg的來源

1.1.1炎癥情況下從引流淋巴結遷移而來當眼部組織發生感染、過敏、自身免疫病等炎癥反應時，抗原刺激免疫細胞在外周免疫系統中分化增殖，經引流淋巴結遷移至炎癥部位，其中大量效應T細胞浸潤及炎癥因子高表達促使病情發展；同時Treg細胞也遷移至病灶部位，發揮抗炎作用，抑制病程進展[16-18]。

1.1.2通過前房相關免疫偏倚產生目前普遍認為前房相關免疫偏倚(anterior chamber associated immune deviation, ACAID)是維持眼部免疫耐受的主要機制，不斷有研究證實，ACAID與角膜移植、自身免疫性葡萄膜炎以及眼內腫瘤的發病機制都密切相關[8, 19-20]。當抗原進入前房，誘導出一種特殊的全身性免疫現象——F4/80+抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APCs)捕獲眼部來源的抗原并運送至脾臟，使CD4+和CD8+α/β調節性T細胞抑制輔助性T細胞(Th1和Th2)的表達，發揮抑制免疫應答的作用[19]。在誘導ACAID發生過程中胸腺、脾臟、交感神經系統各司其職，發揮著重要的作用。研究發現，脾臟切除或胸腺切除可抑制成年鼠眼前房抗原誘導ACAID發生，導致嚴重的排斥反應[20]。利用6-羥基多巴胺(6-OHDA)化學性去交感神經法可以抑制小鼠胸腺NK T細胞和脾臟CD8+Treg細胞的產生，進而阻礙ACAID[21]。

1.1.3炎癥情況下在眼睛內部誘導產生除了通過ACAID途徑誘導Treg生成，眼房水構成的眼內微環境在Treg的分化及免疫調節反應中也發揮著重要的作用。房水主要由虹膜和睫狀體色素上皮細胞分泌，房水中的TGF-β和維甲酸(RA)是Treg細胞生成的關鍵因子，此外，多種神經肽成分：α-促黑素(α-MSH)、血管活性長肽(VIP)、降鈣素基因相關肽(CGRP)和生長抑素(SOM)等都影響Treg分化及功能[22-24]。有研究通過收集小鼠眼房水，體外培養Na?ve CD4+T 細胞，可誘導生成CD4+Foxp3+Treg細胞，推測眼房水多種細胞因子構成的微環境影響Treg生成。此外，該研究發現Treg細胞可在眼內直接誘導生成，小鼠EAU模型的眼組織內Treg細胞比例增高，明顯高于外周血和引流淋巴結中Treg百分率。推測炎癥反應破壞眼部血-眼屏障，大量CD4+T細胞進入眼內，進而誘導生產Treg細胞，有利于控制炎癥；當Treg細胞的抑制能力超過Th1、Th17的致炎作用時，可誘發免疫耐受作用，保護眼組織[25]。

1.2調控眼部Treg產生的相關因子叉頭蛋白Foxp3(forkhead box protein 3)是調控Treg細胞發育和功能的關鍵轉錄因子，大量研究顯示Foxp3+Treg細胞在不同物種的免疫耐受方面起著重要的調控作用[26]。目前已發現IL-2R/STAT、TGF-β/SMAD、Notch1等多條信號通路參與Foxp3轉錄[27-29]，但關于調控眼部Foxp3表達的分子機制的報道較少。c-Rel作為NF-κB家族成員之一，可在Treg細胞發育的早期階段促使Foxp3表達，從而特異性上調CD4+CD25+胸腺Treg細胞的發育[30-31]。已有研究發現，在缺失c-Rel的OTⅡ轉基因小鼠眼前房中注射卵清蛋白OVA誘導炎癥反應，發現CD4+CD25+Foxp3+細胞比例和絕對值均明顯降低，而且Foxp3的mRNA水平明顯下調，因此推測c-Rel在眼內Treg細胞的產生過程中發揮了重要的作用[32]。

2 Treg細胞功能異常與角膜移植排斥之間的關系

正位穿透性角膜移植術是指供體植片位于角膜中央或旁中央的移植手術，不破壞角鞏膜緣正常解剖結構，術后轉歸與前房水中抗炎、免疫抑制相關細胞因子有直接關系。經典的角膜移植排斥理論認為：當眼部接受了同種異體角膜移植后，異體抗原被角膜緣處的APCs識別、俘獲，提呈給次級淋巴器官的T 細胞并使其活化，活化的T 細胞經體循環和角膜新生血管/淋巴管轉送至角膜，對異體角膜發動免疫攻擊，引起免疫排斥反應[33]。這種精密調控的免疫反應高度依賴于免疫細胞向淋巴組織或炎癥部位的定向遷移和歸巢，并受黏附分子、趨化因子的復雜調控[34-35]。

研究表明，Treg細胞可參與眼局部免疫微環境的穩定調節，在角膜移植免疫排斥反應中發揮著重要作用。Chauhan等[36]在小鼠行同種異體角膜移植術后，檢測術后耐受與發生排斥小鼠的植片和局部引流淋巴結內Treg細胞的數量及功能，證實Foxp3+Treg細胞在眼局部參與了角膜移植術后免疫耐受的形成。實驗發現，耐受組和排斥組的引流淋巴結(下頜淋巴結、頸部淋巴結)和供體角膜中Treg的比例無明顯變化，耐受組小鼠引流淋巴結Treg細胞中Foxp3蛋白和mRNA水平均高于排斥組，推測眼部引流淋巴結Treg細胞中Foxp3的表達情況與免疫耐受程度相關，高表達Foxp3的Treg細胞具有更強的免疫抑制功能。一般認為，Treg細胞主要在引流淋巴結和炎癥組織發揮免疫調節作用[37-38]，但也有研究報道，在角膜排斥模型中，Treg細胞是在引流淋巴結中抑制T細胞的致敏效應，而對炎癥反應部位——移植角膜組織中的效應T細胞并沒有理想的抑制作用；相對于排斥組，移植成功組淋巴結的Treg細胞有較強的抑制T細胞活化的作用[36]。

角膜移植過程中外來抗原不可避免地進入前房，從而誘導發生ACAID，由ACAID產生的Treg細胞是否抑制排斥反應，目前尚無明確的定論。雖然角膜移植后誘導產生的Treg表型是CD4+CD25+Foxp3+，但ACAID發揮作用的是CD8+Treg細胞[1,36]。有研究報道，在豚鼠-兔之間異種角膜移植過程中，通過T細胞免疫受體動物，產生的CD8+Treg細胞可抑制角膜排斥反應[39]。相反地，另有研究報道，阻斷CD8+T細胞產生可抑制ACAID發生，但不影響角膜供體的存活時間[40]。

除了ACAID途徑，有報道稱Treg細胞相關性角膜移植耐受是通過“糖皮質激素誘導型腫瘤壞死因子家族相關性配體(GITRL)”依賴性程序調控完成，GITRL主要在角膜內皮、虹膜睫狀體細胞中表達，行角膜移植術后3wk，成功的供體角膜可見Foxp3+GITR+CD25+CD4+T細胞浸潤。使用GITRL阻斷性抗體可使CD4+Foxp3+細胞明顯減少，導致所有同種異體角膜移植模型發生排斥，但不阻止ACAID發生，推測GITR/GITRL介導的角膜移植保護機制并非通過ACAID實現[41]。另外有研究報道指出，角膜供體移植后產生CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞，可以直接抑制供體特異性遲發型超敏反應[40-41]。

3 Treg細胞與角膜移植排斥治療

由于藥物治療排斥反應的作用非常有限，免疫細胞治療已成為目前研究的新領域，通過不同的給藥途徑，如過繼轉移技術，靶向Treg細胞來治療角膜移植排斥反應，不斷增加的實驗性研究為提高移植物存活率帶來新希望。

3.1增加體內Treg細胞的總數量

3.1.1直接注射Treg細胞增加體內正常Treg細胞數量，發揮免疫耐受功能是治療角膜移植排斥的主要觀點。有研究通過分離正常小鼠來源的Treg細胞或經體外擴增Treg細胞，經尾靜脈注射途徑可增加角膜移植成功率[42]。相反地，Antonia等[43]研究報道，分離大鼠脾臟中Treg(CD4+CD25+)，通過尾靜脈注射、球結膜下注射兩種方式治療不同年齡(3周齡和10周齡)的角膜移植大鼠，球結膜下注射可降低3周齡組66.7%的排斥率，10周齡組可降低33.3%，推測可能與效應T細胞 (Teffs) 數量不同有關，成年大鼠體內Teffs較多，相同數量Treg干預后影響就會較小；但尾靜脈注射的方法未能明顯抑制排斥反應，推測可能是由于細胞在血液中受白蛋白或其他抗體破壞，無法有效到達眼部發揮作用。此外，輸注的細胞數量(1×105/只)較其他報道(1×106/只)的少也可能是影響實驗結果的主要原因之一。

3.1.2刺激體內Treg細胞的分化和擴增

3.1.2.1全反式維甲酸和TGF-βWang等[44]研究發現小鼠行角膜移植術后聯合使用全反式維甲酸和TGF-β，可出現外周血、脾臟和引流淋巴結中Treg數量增加，Foxp3表達比例增高等現象，術后移植排斥率明顯降低，推測維甲酸和TGF-β可通過擾亂Treg/Th17平衡、增加Treg分化、誘導免疫耐受來發揮抗排斥作用。

3.1.2.2白介素-2細胞因子之間通過相互影響調節細胞生長、分化，調控免疫應答，白介素-2受體α鏈(IL-2Rα/CD25)被認為是調節CD4+T細胞活化、分化的關鍵性分子，雖然所有活化的T細胞均表達IL-2Rα，但只有Treg細胞持續高表達，因此可以低劑量使用IL-2來選擇性活化Treg細胞而不影響其他效應T細胞，從而達到治療的目的[45]：通過腹腔內低劑量注射IL-2體內擴增Treg細胞，可增加小鼠角膜移植成功率[46]。

3.1.2.3雷帕霉素雷帕霉素(rapamycin)屬于大環內酯類抗生素，起初被研究作為低毒性的抗真菌藥物，而后期有研究發現，行高危角膜移植術的患者使用雷帕霉素后可提高供體成活率[6]。Wang等[47]學者在小鼠行異體角膜移植術前2wk腹腔注射雷帕霉素，研究發現，術前和術后小鼠外周血、引流淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例明顯增加，并且有大量CD4+CD25+T細胞浸潤角膜供體、結膜組織，供體中Foxp3 mRNA水平表達增加，推測雷帕霉素可增加Treg細胞的產生從而發揮免疫抑制作用。以上結論與Shin等[48]關于骨髓移植的研究一致：雷帕霉素與白介素2(IL-2)聯合運用可誘導CD25-T細胞向Treg分化，從而抑制移植物抗宿主病。因此，為了維持穩定的免疫抑制狀態，雷帕霉素-殼聚糖/聚乳酸納米顆粒已被用于延長角膜供體成活的相關研究[49]。

3.1.2.4FTY720FTY720(fingolimod)是近幾年研發的一種新型免疫抑制劑，通過結合1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate)受體影響相關信號通路，抑制T細胞從胸腺和二級淋巴組織中遷出[50]。Miller等[51]發現FTY720不會抑制抗原特異性CD4+T細胞的應答反應，而是通過增加Treg細胞在淋巴結中的數量；增強Treg細胞功能來發揮免疫抑制作用。局部使用0.5% FTY720可提高小鼠角膜移植成功率，同時可在頸部引流淋巴結中檢測到更高比例的的CD4+Treg細胞[52]。

3.2增加眼局部的Treg細胞數量除了增加全身Treg細胞數量，也可通過誘導Treg細胞遷移至病灶來降低排斥。來源于同種異體角膜移植受體引流淋巴結的Treg細胞高表達CCR7、CD62L，這些歸巢受體控制Treg細胞從胸腺遷移至淋巴結皮質，移植成功組比排斥組Treg細胞高表達CCR7，間接體內實驗通過CCL21刺激原始Treg細胞表達CCR7，可促進Treg細胞歸巢引流淋巴結，并提高角膜移植成功率[53-54]

4小結

Treg細胞在維持免疫穩態、預防自身免疫和慢性炎癥方面發揮著重要的作用，通過調控Treg細胞來誘導免疫耐受的免疫治療具有良好的運用前景，特別在器官移植和自身免疫性疾病等領域。盡管人類對Treg細胞的分化和功能的認識不斷更新，但仍有大量的問題尚未解決，譬如細胞表面標記多樣化，對Treg細胞的分型、功能沒有統一且全面的認識；機體中Treg細胞數量少、難獲得；免疫治療過程中Treg細胞的穩定性、效能、純度等問題。相信隨著對Treg細胞的免疫抑制機制、表型可塑性和功能適應性等研究的不斷深入,將會大大促進利用Treg細胞來降低角膜移植排斥的應用。