干細胞來源外泌體對肝臟再生的作用

呂夢嬌 陳小華 臧國慶

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。外泌體是細胞核內體和細胞膜融合后釋放到細胞外的膜性囊泡，能攜帶蛋白質和各種RNA到靶細胞，調控靶細胞的生物學功能。干細胞來源外泌體因在疾病的檢測、預防和治療方面的作用已經成為醫學研究的熱點。本文就各類干細胞來源外泌體在肝臟再生方面的研究進展作綜述。

一、外泌體的生成機制與特點

外泌體(exosome)最初是從體外培養的羊網織紅細胞的上清液中發現的[1]，由細胞核內體萌發形成多泡體(MVB)并與細胞質膜融合釋放到細胞外[2]，直徑30-150nm，密度1.10～1.18 g/mL的囊泡樣小體。幾乎所有類型的細胞都能分泌外泌體，并且在體液如唾液、血液、尿液、滑膜液、母乳和羊水中大量存在[3]。研究表明，外泌體含有多種蛋白質、mRNA、miRNA及各種脂類，可作為信息傳遞的載體，參與細胞通訊、遷移、血管生成、組織修復、腫瘤細胞生長、免疫調節及炎癥反應等過程，成為細胞交流的一種新的方式[4-6]。對于外泌體的提取，超速離心法是經典的方法，但耗費時間長，研究發現，用抗EpCAM包被磁珠分離的免疫親和性捕獲法(IAC-Exos)是分離外泌體最有效的方法，但費用昂貴，當IAC-Exos使用受限時，用OptiprepTM 基于密度的分離法(DG-Exos)更有優勢[7]。現在也可以使用改良Exoquick TC法，更為簡便。目前，外泌體是研究的熱點，作為生物標記物、載體及其直接治療作用成為許多疾病的早期診斷、臨床治療以及預后判斷的潛在手段。

二、干細胞來源外泌體

干細胞(stem cell)是一類具有自我持續更新和多方向分化潛能的未分化細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能。根據其所處的發育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據其發育潛能分為：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞(專能干細胞)。干細胞因能修復組織損傷細胞、替代損傷細胞以及刺激機體自身細胞再生等功能廣泛應用于組織修復及缺血性疾病的治療領域，但在體細胞誘導率、細胞移植培養條件、形成畸胎瘤的可能性等方面仍然存在許多問題。干細胞外泌體是干細胞旁分泌的脂質囊泡，攜帶并保持干細胞內蛋白質和mRNA的活性，可直接進入靶細胞發揮生物學作用，具有更高的生物安全性和更穩定的信號轉導效率[8]。因此，干細胞外泌體是成為新興的研究熱點，將為許多疾病開啟新的治療方法。

三、干細胞來源外泌體對肝臟再生的作用

肝臟再生可以定義為代償性增生，當肝臟損傷或切除后殘余肝組織增殖以滿足機體代謝需要。肝臟具有強大的再生能力，損傷的類型和程度不同，參與再生的細胞和免疫相關因子也不同，輕度損傷時由肝實質細胞增殖修復，慢性或巨大損傷致肝細胞再生功能障礙時，肝臟祖細胞被激活產生增生反應修復組織[9]。肝臟再生是由先天免疫系統和細胞因子如TNF,IL-6等釋放激活STAT3使得肝細胞從G0期進入G1期開始增殖,是一個由多種細胞增殖，多條信號通路和免疫相關因子參與的復雜調控過程[10]。對于肝再生，臨床上研究結果有活體肝移植和成人干細胞治療[11]。肝移植是治療肝衰竭的有效方法，但肝源緊缺，費用昂貴，大大限制了臨床應用。成體干細胞療法是基于細胞的治療危及生命的肝臟疾病的方法，例如間充質干細胞(MSCs)可以減緩肝細胞的凋亡，改善肝細胞的微環境，促進肝臟細胞的再生，因而可以用來治療急性肝衰竭。但是對于成體干細胞的分離還存在許多困難，不是所有的組織器官都能分離出干細胞，并且數量很少。干細胞外泌體含有干細胞的蛋白質和mRNA,具有和干細胞相似的功能，且外泌體更穩定、更易于儲存，沒有異倍體的風險，免疫排斥的可能性更低，將會為肝臟疾病提供新的治療手段[12]。

(一) 多能干細胞來源外泌體

1. 間充質干細胞

間充質干細胞(MSCs)是一類成體干細胞，具有多向分化潛能，能分化成脂肪、骨、軟骨、肌肉、肝、心肌等多種組織細胞，可作為理想的種子細胞用于組織器官的損傷修復。MSCs分化成肝細胞主要來源于骨髓、脂肪組織、臍帶血及經血等。研究表明，把人臍帶間充質干細胞(hucMSCs)與CCL4誘導的鼠急性肝衰竭損傷肝細胞間接共培養發現hucMSCs能通過旁分泌作用有效促進體外肝細胞再生，而不是肝分化。并且hucMSCs能下調炎癥因子如IL-1β，TNF-α，IL-6,IL-10等的表達[13]。從而說明間充質干細胞通過產生外泌體促進組織損傷修復，成為hucMSC-Exos治療疾病的理論基礎。研究發現，hucMSCs-Exos可以有效地緩解CCL4誘導的肝衰竭，并且通過傳遞GPX1到靶細胞，GPX1能解毒CCL4和H2O2，減少氧化應激和細胞凋亡，從而促進肝氧化損傷的恢復[14]。在對乙酰氨基酚(APAP)或過氧化氫(H2O2)藥物性肝損傷模型中，MSCs-Exos可以通過上調初始基因使增殖蛋白(PCNA,cyclinD1)表達增加和促進抗凋亡基因Bcl-xl表達抑制APAP，H2O2誘導的肝細胞凋亡來激活肝細胞增殖和再生反應，對損傷肝細胞產生保護作用并促進肝再生[15]。研究發現經血來源的間充質干細胞(MenSCs)分泌的外泌體在D-GaIN/LPS誘導的爆發型肝衰竭中能減少肝臟單核細胞以及受損傷肝細胞內凋亡蛋白Caspase-3的數量，從而緩解肝衰竭[16]。大量研究表明，在CCL4誘導的肝纖維化模型中，hucMSC-Exos可通過滅活TGF-β1及減少Smad2磷酸化來抑制上皮-間質轉化(EMT)，減少膠原沉積，保護肝細胞，改善肝纖維化[17]。

2.誘導性多能干細胞

誘導性多能干細胞(iPSCs)被認為具有最高的再生分化潛能，是通過將外源基因導入體細胞使之去分化為多能干細胞。目前的臨床研究顯示iPSCs成為MSCs的一個有吸引力的來源，iPSCs被誘導分化MSCs的重編程過程使得細胞表現出更好的生存、增殖和分化潛能,因此hiPSC-MSCs將作為一種新型的干細胞群在再生領域中發揮作用[18]。研究發現，肌內注射hiPSC-MSCs-Exo于下肢缺血小鼠能增強缺血肢體微血管密度和血流灌注，能激活血管生成相關因子的表達，促進血管生成，從而為缺血性疾病的治療提供新的方法[19]。在肝缺血再灌注70%熱肝I/R損傷模型中，將hiPSC-MSCs-Exo注入下腔靜脈，評估療效，發現hiPSC-MSCs-Exo可抑制肝壞死、減輕炎癥反應、抑制細胞凋亡和抗氧化應激反應，從而減輕缺血再灌注所致的肝組織損傷[20]。之后在大鼠70%肝切除術模型中，也表明了hiPSC-MSCs-Exo能減輕肝組織損傷，促進殘余肝再生并改善肝功能[21]。因此hiPSC-MSCs-Exo將有望成為治療肝缺血再灌注損傷的新手段。

(二)肝干細胞來源外泌體

肝干細胞是存在肝臟內的具有自我更新和多向分化潛能的細胞。研究發現，肝干細胞能表達間充質干細胞標志物CD29,CD73,CD44,CD90,而不表達造血干細胞標志物體CD34,CD45等，在體內實驗中，HLSCs能促進嚴重聯合免疫缺陷小鼠肝實質的再生[22]。HLSCs的特征和功能為人肝干細胞來源的外泌體(HLSC-Exos)在肝再生中的作用奠定了基礎。在70%肝切除大鼠模型中，HLSC-Exos移植能誘導肝細胞增殖，抑制凋亡，且發現肝切除大鼠肝中人類AGO2mRNA和denovo蛋白表達，而用RNase處理則效果消失，表明HLSC-Exos將特定mRNA分子水平傳遞給大鼠肝細胞來促進肝切除大鼠肝再生[23]。從而表明肝干細胞來源外泌體也能促進肝再生,但具體的機制以及起作用的相關因子還需要進一步研究。

四、干細胞來源外泌體在肝臟再生中的應用

干細胞來源外泌體將是肝臟再生領域一種新的治療策略，大量研究表明，干細胞來源外泌體能夠通過抑制炎癥反應，抑制細胞凋亡，減少膠原沉積，促進肝細胞增殖來保護肝組織和促進肝臟再生，初步驗證了其治療的有效性和安全性，但還存在一些挑戰，如從干細胞中提取的外泌體量非常少，如何大量提?。繉τ趯RNA和蛋白質轉運到靶細胞中起主要作用的是哪種成分？以及參加肝臟再生的其他機制等等。但相信隨著技術研究的發展，干細胞外泌體將會為肝再生帶來福音。