禽流感病毒疫苗研究進展

周賽賽，貢 嘎，錢雯嫻，王一飛，索朗斯珠

（西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000）

流行性感冒(簡稱流感)，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，是首個實施全球性監測的傳染病[1]。流感病毒有甲（A）、乙（B）、丙（C）、丁（D）型，A型流感病毒可分為18個HA亞型、11個NA亞型[2]，A型流感病毒因抗原變異、傳染性大、傳播快等因素，H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2等亞型流感易造成禽、豬、人等大范圍流行，與其他亞型流感相比流行更嚴重[3]；近期已在人的身上分離出H10N8、H9N2、H7N9、H7N2、H5N6、H5N1、H3N2、H1N1等多個亞型。OIE曾經將高致病性禽流感列為A類動物疫病，我國也曾將高致病性禽流感列為一類動物疫病[4]。自20世紀以來，全球范圍內爆發過6次大流感，分別是“西班牙流感”（1918-1919年）由H1N1亞型病毒引起，是人類歷史上最大的傳染病，幾乎同時傳遍歐洲、亞洲、北美洲，11個月死亡人數超過第一次世界大戰死亡人數的三倍（約5 000萬人死亡）；“亞洲流感”(1957-1958年)由H2N2亞型流感引起，首發于我國貴州省，8個月席卷全球，此次流感大流行導致至少100萬人失去生命；“香港流感”（1968-1969年）由A型H3N2流感引起，導致全球多于100萬人死亡；美國“豬流感”（1976-1977年）由豬H1N1亞型流感引起，導致200余人感染，1人死亡，因四分之一的美國人注射了疫苗，并未造成重大疫情；“俄羅斯流感”（1977-1978年）由1950年H1N1亞型流感的變異株引起，因老年人曾經被原毒株感染過，擁有抵抗力和免疫力，此次青少年發病較高；“2009甲型流感”（2009-2010年）由新型A型H1N1流感病毒引起，導致近2萬人死亡[5,6]。在流感預防方面，除防止禽-豬-人流感病毒相互重組外，接種疫苗是目前最有效的方法；因流感病毒亞型較多、易突變，使各國學者在研制疫苗方面困難重重。本文將對國內外不同性質種類的流感病毒疫苗研究進展進行綜述。

1 禽流感病毒疫苗的原理及分類

疫苗是一種免疫保護性生物制品，經機體識別后，結合機體后產生免疫機制，誘導機體產生特異性抗體，以此抵抗病原體的侵襲，并產生細胞免疫和體液免疫，或僅一種免疫方式，同時產生記憶性免疫細胞，建立起長期抗感染或減小毒力作用[7]。隨著各國學者對疫苗的研究，疫苗可分為治療疫苗和預防疫苗，根據性質可分為禽流感病毒基因工程疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗、載體疫苗、通用疫苗等。

2 禽流感病毒疫苗的研發與應用

2.1 禽流感病毒滅活疫苗

滅活疫苗是用甲醛或其他滅活劑滅活流感病毒雞胚尿囊液或細胞培養液，再輔加佐劑制成。該滅活苗安全性高、免疫原性強、可制備多價苗、不出現返強和變異現象，是目前被廣泛應用的疫苗，主要包括自然分離株和重組病毒研制的疫苗。自2003年起，農業部指定研制了禽流感滅活疫苗，如華南農業大學、揚州大學生物制品研究開發中心等研發的二類禽流感滅活疫苗(H9亞型：SS株），得到農業部批準，其作用安全有效。如今禽流感病毒滅活疫苗得到了有效的發展，如吳姣姣等[8]運用重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活疫苗對商品肉雞進行免疫保護，對免疫商品雞攻H5亞型和H7亞型禽流感強毒后，發現該滅活疫苗具有良好的免疫效果。章振華等[9]運用雞新城疫(ND)-傳染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI)(H9亞型)三聯滅活疫苗對雛雞進行免疫，結果對7～14 d雛雞免疫保護效果較好。Ali A等[10]運用三價滅活油乳劑疫苗，對感染H5N8亞型高致病性禽流感病毒和毒性基因型VII新城疫病毒的SPF雞進行免疫，該三價滅活苗具有顯著的臨床保護作用。

2.2 禽流感病毒基因工程疫苗

基因工程疫苗是將病原的基因片段連接到表達載體，再轉染到細胞或真核、原核細胞微生物后得到的產物；或者將病原的毒力相關基因刪除掉，使成為不帶毒力相關基因的基因缺失苗。可分為禽流感病毒基因工程亞單位疫苗、重組活載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失或突變疫苗、合成肽疫苗等。

2.2.1 禽流感病毒基因工程活載體疫苗 基因工程活載體疫苗是用分子生物學技術來分離禽流感病毒抗原血凝素或神經氨酸酶等基因，并將抗原插入新城疫病毒、痘病毒、皰疹病毒、反轉錄病毒等載體中，構建表達抗原的重組病毒。2005年中國農業部批準生產了中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所研制的世界首個二類禽流感-新城疫重組雞痘病毒載體活疫苗（H5亞型）[11]。因活載體疫苗可以是致病性微生物經基因工程的方法修飾或去掉毒性基因以后，仍保持免疫原性，或是非致病性微生物經基因工程方法使之攜帶并表達某種特定病原的抗原，產生免疫原性誘導機體產生免疫應答。國內外學者Bertran K等[12]應用H5亞型禽流感病毒重組新城疫疫苗和皰疹病毒疫苗，在接種后丙二醛可增強重組新城疫疫苗產生保護性免疫。Chang P等[13]將流感血凝素（HA）抗原插入鴨腸炎病毒基因組，可用于預防鴨流感病毒感染。雖然，活載體疫苗有很多優勢，但活載體疫苗有可能保存一定活力、對保存和運輸要求較高。

2.2.2 禽流感病毒樣顆粒疫苗 流感病毒樣顆粒疫苗是將流感病毒的抗原基因克隆到桿狀病毒系統內，經細胞表達后自組裝制成，可模擬病毒的免疫原性，能誘導機體產生體液和細胞免疫，且病毒樣顆粒不含病毒基因組和相關抗原，不能在細胞內復制，無感染性，適用人群廣泛。為此國內學者童彥軍[14]潘學等[15]利用H7N9、H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因，建立了一種H7N9、H9N2亞型流感病毒顆粒疫苗制備的方法，小鼠實驗表明對流感病毒效果良好且可產生交叉免疫反應。

2.2.3 禽流感病毒基因工程亞單位疫苗 基因工程亞單位疫苗是通過基因工程方法取出編碼保護性抗原的基因，將基因和質粒等載體重組，再轉化至受體菌或細胞中，獲得大量保護性肽段，然后再加入適量疫苗佐劑制成。亞單位疫苗所具有的優點不僅安全性好，而且在刺激免疫保護力上具有很強的作用，對人類、動物和生態環境無潛在危害。我國學者范文輝等[16]周陳陳等[17]將H5、H7亞型流感病毒HA蛋白基因，經篩選得到表達重組菌，獲得濃縮純化的目的蛋白，加佐劑研制成H5、H7亞型亞單位疫苗，經免疫SPF雞試驗，表明該疫苗具有良好免疫效果。Flood A等[18]利用冷凍干燥技術開發了兩種干燥型H1N1流感亞單位疫苗，經免疫小鼠試驗，表明該疫苗具有安全免疫原性。在佐劑的利用方面，Chen T H等[19]使用一種新型PELC/CPG佐劑開發重組H7N9亞單位疫苗，經肌內免疫BALB/C小鼠后，用這種佐劑配制的重組H7HA蛋白在血清中引發更高的IgG和病毒中和抗體，在脾臟中誘導更多T細胞分泌抗體和IFN-γ，并對小鼠提供更好的保護作用。為了優化免疫方式Dhakal S等[20]用10種高度保守的B和T細胞表位肽的脂質體納米顆粒（R＜200 nm）為基礎，用尿酸單鈉（MSU）晶體作為佐劑的亞單位流感疫苗，對H1N1亞型流感感染進行保護性免疫保護，并以鼻內噴霧的形式給豬接種疫苗，表明保護了豬免受流感引起的發熱和肺炎的損害。但是亞單位疫苗缺點在于免疫原性差、成本高、抗體持續時間短、有些甚至是半抗原、需要與蛋白載體偶聯后使用等。

2.2.4 禽流感病毒核酸疫苗 核酸疫苗是利用分子生物學、免疫學、生物化學等方法研制成的DNA疫苗或RNA疫苗；將可表達保護性免疫原基因(DNA或RNA)導入動物體細胞內，誘發機體宿主細胞通過合成抗原蛋白，誘導宿主產生免疫應答，核酸苗的研究以DNA疫苗為主，DNA疫苗因不需要任何化學載體而又叫裸疫苗。因DNA分子較穩定、與傳統疫苗相比安全、不用加佐劑、產成本較低等優點，我國學者賈云慧等[21]經研究以歐亞類禽型H1N1豬流感病毒HA蛋白作為靶抗原，制備DNA疫苗，經免疫BALB/c小鼠表明產生高水平的HI和VN抗體，對同源歐亞類禽型H1N1豬流感的感染有完全保護作用，對異源pdm H1N1/2009豬流感的感染也有叉免疫保護效果。Yao Y等[22]研究了H1N1亞型流感病毒M2蛋白，N端胞外區為靶抗原，研發了M2E DNA疫苗，經免疫小鼠發現這兩種疫苗可保護人類免受H1N1亞型病毒的致命感染。RNA疫苗可分成兩類型，一種是常規下的mRNA疫苗，一種是自我擴增的mRNA疫苗。國外學者Norbert P等[23]使用核苷修飾和純化的編碼全長流感病毒HA的mRNA，該病毒以脂質納米粒形式配制，經免疫小鼠、兔子和雪貂，是一種有效、具有廣泛保護作用的流感病毒候選疫苗，表明在注射部位和淋巴結中天然免疫反應的強烈激活，mRNA疫苗可以與滅活病毒的疫苗競爭，甚至在功能性抗體和T細胞反應方面更優越。經過我國科研工作者的不斷努力，2018年中國農村農業部批準了中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所等單位的首個一類禽流感DNA疫苗（H5亞型，pH5-GD）的生產。

2.3 禽流感病毒減毒活疫苗

減毒活疫苗是禽流感病毒經處理后，毒性亞單位結構改變，但結合亞單位的活性保持不變，使疫苗保持了抗原性且達到減毒的目的。隨著基因工程技術的發展，因減毒活疫苗與滅活疫苗相比可誘導體液免疫和細胞免疫、在機體內長時間起作用、而只需接種一次、無需加佐劑、價格低廉等優點。國內外學者劉梅等[24]Mamerow S等[25]運用禽流感病毒NS1基因缺失或突變的減毒活疫苗，對豬、小鼠或蛋雞進行免疫免疫，結果表明小鼠和豬既沒有出現臨床癥狀且對雞有良好保護，也沒有檢測到病毒復制。Wan Z等[26]利用A型H3N2和H1N1流感病毒和兩個B型流感病毒抗原譜系，制成的競爭性減毒活流感病毒疫苗配方，可提供有效的保護。但減毒活疫苗缺點是有一定殘余毒力、可能有“毒力返祖”現象、產品的分析評估困難、保存和運輸等條件高等；因此，目前我國還未有被批準的禽流感病毒減毒活疫苗。

2.4 禽流感病毒通用疫苗

流感通用疫苗原理是破壞流感病毒各亞型共有的蛋白，蛋白為HA、M2，因蛋白幾乎未發生變異，為研發提供了充分的理論基礎，該疫苗對病毒各亞型都具有一定的交叉保護性，流感病毒防控方面具有重要意義。因通用疫苗是人們最想得到的理想疫苗，僅有個別國外學者對其研究，如Rowell J等[27]利用A型流感病毒相對保守的NP和M2抗原，研究了一種通用流感疫苗，該疫苗經小鼠鼻內給藥試驗，該疫苗對有不同呼吸道感染史的人群也有效。Sun W等[28]利用A、B型流感病毒，將A型流感血凝素的相應序列替換B型流感血凝素的主要抗原位點，產生鑲嵌B血凝素，并將其表達可溶性三聚體蛋白，研制了一種新的基于鑲嵌血凝素的通用B型流感病毒疫苗，結果該疫苗對同源和異源性B型流感病毒株產生交叉保護作用。通用禽流感疫苗的優點在于此疫苗可預防所有常見流感，保護時間長等。

3 小結和展望

自20世紀30年代，各國學者開始研制流感病毒疫苗，在過去幾十年中，隨著新技術的發展和各國學者對流感病毒研究的不斷深入，從最初2003年批準的單價禽流感病毒滅活苗到2018年基因工程DNA疫苗的批準，禽流感病毒疫苗已經獲得較快的發展。通過對中國農業農村部的公告統計，自2003年至2018年我國部門陸續批準了H5和H9亞型不同毒株的單價和二價禽流感滅活疫苗；在2003年我國首次出現新城疫、禽流感（H9亞型）二聯滅活疫苗；隨后十年間我國不斷出現三聯、四聯重組滅活疫苗；直到2014年后我國未見四聯苗的批準；我國科研工作者開始著眼于單價滅活疫苗、二價滅活疫苗、二聯和三聯滅活疫苗的研發，如我國的三聯苗，通過對肉仔雞免疫雞新城疫+傳染性支氣管炎+禽流感三聯滅活疫苗，對H9亞型禽流感的免疫效果達100%；隨著細胞源禽流感病毒在質量、穩定性、含量和純凈性等方面突出的優點，近兩年我國對（H5+H7）亞型禽流感病毒重組二價滅活疫苗毒株也傾向于用細胞源毒株。

由于流感病毒亞型較多，基因重組等問題，雖已經研發出各種流感病毒疫苗，但疫苗在臨床應用中仍然有較多缺點，為此各國學者也在積極研發高效、安全、低成本的新型流感病毒疫苗，新型流感病毒疫苗將在人類防控流感過程中發揮重要作用。通用疫苗是人們期盼多年的疫苗，但提高該苗對變異株的廣譜能力是一個難題，從目前研究結果來看，它還很難進入實用，隨著疫苗生產技術的發展，相信在不久的將來會研究出安全性好、免疫原性高的流感疫苗。