百事樂加味方對卒中后抑郁大鼠海馬神經元自噬蛋白的影響

劉羽 劉檢 易亞喬 凌佳 劉麗 邵樂 劉林

摘要：目的? 觀察百事樂加味方對卒中后抑郁（PSD）大鼠神經功能缺損評分、形態學改變及海馬自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表達的影響，探討PSD神經元細胞自噬機制及中藥防治作用。方法 ?采用大腦中動脈栓塞+慢性不可預見溫和應激+孤養法制作PSD模型，分組前進行行為學評分，隨機分為假手術組、抑郁組、卒中組、PSD組、陽性藥組、百事樂加味方組，各給藥組給予相應藥物，連續28 d。HE、Nissl染色觀察大鼠海馬形態;免疫組化檢測PSD大鼠海馬mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ的表達。結果? 與假手術組比較，PSD組大鼠神經功能缺損評分明顯升高，海馬mTOR表達明顯降低，Beclin-1、LC-3Ⅱ表達明顯升高（P<0.01）;與PSD組比較，百事樂加味方組大鼠功能缺損評分顯著降低，海馬組織病理形態明顯改善，海馬mTOR蛋白表達明顯升高，Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結論 ?百事樂加味方可有效改善PSD大鼠行為學、病理學表現，抑制神經細胞異常自噬可能是其抗PSD的重要機制之一。

關鍵詞：百事樂加味方;卒中后抑郁;海馬;自噬;腦缺血;大鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）02-0052-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.012

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Abstract： Objective To observe the effects of modified Baishile Formula on the neurological deficit score and the expressions of mTOR， Beclin-1 and LC-3Ⅱ in hippocampus of post-stroke depression （PSD） rats; To explore the preventive and therapeutic mechanism of TCM for post-stroke depression from neuronal autophagy. Methods The rat model of focal cerebral ischemia was established by the method of middle cerebral artery occlusion （MCAO）， and the PSD model was established by combining with chronic unpredictable mild stress （CUMS） and solitary nourishment. The behavioral scores were evaluated by Longa grading method before dividing the groups. The rats were randomly divided into sham-operation group， depression group， post-stroke group， PSD group， positive medicine group and modified Baishile Formula group. Each administration group was given relevant medicine for 28 d. The morphological changes of hippocampus were observed by HE staining and Nissl staining. Immunohistochemical method was used to detect the expressions of mTOR， Beclin-1 and LC-3Ⅱ in hippocampus of PSD rats. Results Compared with the sham-operation group， the neurological deficit score of the PSD group significantly increased， the expression of mTOR in the hippocampus significantly decreased， and the expressions of Beclin-1 and LC-3Ⅱ significantly increased （P<0.01）. Compared with the PSD group， the neurological deficit score of the rats in modified Baishile Formula groupsignificantly decreased， the pathological morphology of the hippocampus wassignificantly improved， the expression of mTOR protein in the hippocampus significantly increased， and the expression of Beclin-1 and LC-3Ⅱ proteins significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Modified Baishile Formula can effectively improve the behavioral and pathological symptoms of PSD rats and inhibit autonomic phagocytosis. It may be one of the important mechanisms of treating PSD.

Keywords： modified Baishile Formula; post-stroke depression; hippocampus; autophagy; cerebral ischemia; rats

自噬是機體在缺血、缺氧等狀態下發生的一種應激反應，在腦血管、神經功能疾病中占有至關重要的地位，是防治卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）的潛在機制之一。百事樂加味方是“百事樂”（專利號ZL20101010856.X）為基礎加味而成，具有活血疏肝、解郁通絡、養心安神、健脾化痰功效，臨床常用于肝氣郁結、痰瘀阻絡證患者，其有抗PSD及改善神經功能作用^[1-2]，但其作用機制有待進一步深入探討。因此，本研究采用形態學和免疫組化方法觀察百事樂加味方對PSD大鼠海馬病理形態改變和自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表達的影響，從海馬神經細胞自噬方面探討復方中藥防治PSD可能的作用機制，為臨床應用提供依據。

1? 實驗材料

1.1? 藥物

百事樂加味方（柴胡、姜黃、人參等），飲片由湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供;鹽酸氟西汀片，禮來蘇州制藥有限公司，20 mg/片，批號3435A;阿司匹林片，舒泰神生物制藥股份有限公司，50 mg/片，批號170803。

1.2? 動物

SD大鼠80只，SPF級，雄性，體質量（200±20）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級動物實驗室，溫度18～22 ℃、相對濕度40%～50%，自由攝食飲水。

1.3? 主要試劑與儀器

山羊抗兔/小鼠IgG、DAB顯色液，中杉金橋生物試劑公司;甲苯胺蘭，上海試劑三廠;mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ一抗，Bioss公司;多聚甲醛，天津市科密歐化學試劑有限公司;水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司。TDZ4-WS離心機（湖南湘儀），血液混勻儀（北京宏潤達），AUW2200分析天平（日本島津），BC51顯微鏡（日本奧林巴斯）。

2? 實驗方法

2.1? 造模

參照改良Koizumi法^[1]制作局灶性腦缺血大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉;頸部正中切口，鈍性分離右頸總動脈（CCA）主干、CCA分叉、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）;相繼結扎CCA主干和ECA近心端，在CCA主干遠端及ICA根部穿線備用;用微動脈夾暫時夾閉ICA遠端;在距CCA分叉部3～4 mm處用眼科剪剪一小口，插入線栓，使線栓從CCA順行進入ICA，松開ICA的微動脈夾，使線栓略呈弧形，向外上方的角度緩慢順著ICA走向插入，防止誤插入翼腭動脈（PPA）。若只插進約10 mm就有明顯阻力則提示誤插，此時可緩慢退出后調整方向再插，直到阻力感較明顯時停止插入，此時插入深度為18～20 mm（從CCA分叉處計算），說明線栓到達大腦中動脈（MCA）起始段，將阻斷進入MCA的血流，引起局灶性腦缺血改變。結扎CCA主干遠端及ICA根部備線，防止線栓脫落，剪斷多出的栓線;生理鹽水清洗，消毒棉球清潔手術野，逐層縫合。注射用青霉素鈉鹽4萬U/只腹腔注射，預防術后感染^[2-3]。手術大鼠單籠孤養，術后恢復7 d后，再給予28 d慢性不可預見溫和應激（CUMS），包括禁食、禁水、行為限制、潮濕墊料、晝夜顛倒、傾籠、夾尾7種刺激方法，每種方法使用4次，隨機分布于4個應激周期中，制作PSD模型。

2.2? 分組

大鼠在預養期間進行蔗糖水消耗訓練實驗和曠場實驗行為評分，測定蔗糖水消耗實驗和曠場實驗的基線值，從中篩選出行為評分均一的大鼠，隨機分為假手術組、抑郁組、卒中組、PSD組、陽性藥組、百事樂加味方組（中藥組）。隨機補充手術后死亡的大鼠和應激過程及實驗過程中不可預料因素致死的大鼠，使每組最終達到8只。假手術組：給予假手術處理，除栓線不插入頸總動脈外，其余操作同卒中組。采用線栓法制備局灶性腦缺血MCAO模型，選擇術后神經功能缺損評分>1分且<4分大鼠入組，每籠4只飼養;抑郁組：CUMS結合孤養法制備慢性應激抑郁模型;PSD組：MCAO模型大鼠術后恢復7 d后加以孤養法結合CUMS法。

2.3? 給藥

除假手術組與卒中組外，其余各組大鼠應激造模28 d，各組均于應激造模同時給藥，陽性藥組大鼠灌胃給予氟西汀（0.005 4g/kg）+阿司匹林（0.27 g/kg），中藥組大鼠給予百事樂加味方煎液（23.5 g/kg）灌胃，假手術組、卒中組、抑郁組、PSD組大鼠均灌胃蒸餾水。給藥體積均為10 mL/kg，連續28 d。

2.4? 指標檢測

2.4.1? 神經功能缺損評分

分別于MCAO造模分組及應激后每周按照Longa分級法^[4]進行行為學評分：0分為無缺陷;1分為不能伸展對側前肢;2分為對側前肢屈曲;3分為輕度向對側轉圈;4分為嚴重向對側轉圈;5分為向對側跌倒進行。觀察各組神經功能缺損評分情況。

2.4.2? 海馬組織神經細胞形態觀察

灌胃給藥28 d后，取材前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，腹主動脈采血處死，迅速4%多聚甲醛從心臟灌注固定，取大腦海馬組織經脫水、透明、浸蠟與包埋，將蠟塊常規切片，HE、Nissl染色觀察形態學變化。

2.4.3? 海馬自噬相關蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ檢測

大鼠處死后，4%多聚甲醛固定，取大鼠海馬組織，經脫水、透明、浸蠟與包埋，切片，免疫組化檢測大鼠細胞凋亡因子mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表達。

3? 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗，多組均數比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 神經功能缺損評分結果

與假手術組比較，PSD組大鼠神經功能缺損評分明顯升高（P<0.01）;與PSD組比較，中藥組大鼠神經功能評分明顯降低（P<0.01）。

4.2? 百事樂加味方對模型大鼠海馬病理形態的影響

海馬組織形態觀察顯示，PSD組大鼠海馬組織細胞結構模糊，核固縮，壞死灶邊緣可見炎性細胞浸潤等不同程度的病理損害;經藥物治療后，與PSD組比較，中藥組神經元細胞形態、變性、壞死等病理學改變明顯改善。

4.3? 百事樂加味方對大鼠海馬組織自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ水平的影響

與假手術組比較，PSD組大鼠海馬組織mTOR表達水平明顯低降，Beclin-1、LC-3Ⅱ表達水平明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）;與PSD組比較，中藥組大鼠海馬組織mTOR表達水平明顯上升，Beclin-1、LC-3Ⅱ表達水平明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。

5? 討論

自噬是真核細胞防御和應激調控的生物學機制，具有兩面性：一方面，在細胞營養缺乏時，自噬發揮維持細胞能量穩態的重要作用，在發育過程中有利于組織重塑，清除細胞內有害和過剩的細胞器及病原體，起保護作用;另一方面，過度激活可導致細胞程序性死亡，是引起一系列疾病的病理過程。自噬在中樞神經系統中起著重要的作用，尤其是對維持神經元的功能起著重要的作用，腦卒中缺血、缺氧、應激等狀態均誘導機體自噬失衡，加重神經組織損傷，自噬調節細胞穩態平衡是神經保護作用重要機制。李丹丹等^[5]研究表明，腦缺血引起的缺血、缺氧等應激條件可誘導自噬發生，形成LC3-Ⅱ復合物，LC3-Ⅱ是自噬形成的標記物。徐愛軍等^[6]研究發現，柴胡疏肝散具有顯著的抗抑郁作用，其主要作用機制可能與其降低海馬LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值和Beclin-1蛋白水平，抑制神經元自噬有關。

哺乳動物mTOR是各種形式突觸重塑和記憶形成所必不可少的關鍵激酶，是防治抑郁癥新的重要靶點。mTOR是神經元細胞生長、發育、成熟及功能正常運轉的重要蛋白。mTOR通路抗抑郁研究表明，激活mTOR信號可有利于抑郁癥突觸重塑^[7];PI3K/mTOR/CREB通路活化在大鼠神經退化，突觸和神經傳遞功能障礙，抗氧化應激方面具有保護作用^[8];藥物可通過PI3K/Akt/mTOR通路上調皮質甾酮誘導小鼠抑郁模型海馬mTOR、PSD95及腦源性神經營養因子表達，從而產生抗抑郁作用^[9];或上調mTOR信號通路，調節海馬突觸重塑并緩解抑郁癥狀^[10]。

mTOR-自噬通路是腦神經分子網絡的一條重要的調控軸，mTOR-自噬調控失衡是抑郁癥的主要發病機制^[11]。mTOR介導自噬信號通路調控神經分子網絡可能是PSD突觸重塑新機制。已有研究報道，mTOR/自噬調控信號通路在腫瘤、糖尿病、心腦血管等疾病中起重要作用，尤其在腦血管并發神經性疾病^[12-14]。mTOR是調控自噬的關鍵信號分子，mTOR/自噬調節平衡是神經元細胞存活、突觸重塑的重要因素。在腦缺血缺氧（腦卒中）損傷及應激等狀態均可以激發mTOR/自噬信號調控的失衡，激活自噬是抑郁癥的主要發病機制^[9];在缺血再灌注大鼠模型中，間歇性缺氧激活mTOR/自噬通路，增加細胞自噬，加重神經細胞損傷^[15]?？挂钟羲幬锓魍∧芡ㄟ^調節mTOR-自噬通路激活mTOR，抑制自噬緩解抑郁癥狀，改善抑郁大鼠模型海馬突觸重塑^[10]。有研究報道，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體參與神經元細胞自噬過程，通過激活誘發神經元細胞自噬進而凋亡，產生抑郁，抑制NMDA受體可激活mTOR通路，抑制自噬，保護神經元突觸可塑性^[16-17];NMDA通過AKT/mTOR介導自噬在其他疾病研究已有報道，目前在PSD中尚未見報道^[18]。

PSD在中醫里未見明確記載，其屬情志疾病中“郁癥”與“中風”之合病，痰瘀互結為主要致病因素，情志不舒、氣機郁滯，氣不布津，聚而成痰，痰濕上擾，蒙蔽清竅，元神失用而致PSD。百事樂加味方中姜黃活血化瘀、行氣止痛，善破肝脾二經之血瘀氣結，主血瘀氣滯諸癥，現代藥理研究表明，姜黃有效成分姜黃素可通過PI3K/Akt/mTOR信號調節細胞自噬^[19];人參大補元氣、安神益智、解郁化痰，其有效成分人參皂苷Rg1可通過抑制海馬神經元異常自噬，從而改善大鼠行為學和神經突觸重塑^[20]。本實驗結果表明，PSD模型大鼠海馬組織mTOR蛋白表達下調、Beclin-1、LC-3Ⅱ表達上調，提示自噬異?；罨荘SD病理機制之一。百事樂加味方干預治療，能有效降低自噬相關蛋白表達水平，抑制異常自噬，改善海馬病理形態，提高神經功能。據此推測，mTOR介導自噬調控失衡，相關神經系統分子網絡功能異常，從而影響海馬突觸重塑障礙可能是PSD的重要機制。但百事樂加味方在PSD神經系統分子網絡作用機制還有待進一步深入探討。

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