DNA及RNA甲基化檢測在腫瘤診斷中的研究進展

趙 琦，相綠竹，彭 瑞，王 曄 綜述,牟曉峰△ 審校

(1.青島大學醫學部，山東青島 266021；2.青島市中心醫院檢驗科，山東青島 266042)

基因甲基化是表觀遺傳學中的一個重要組成部分，是在不改變基因組核苷酸序列的情況下，將有活性的甲基化合物在相關轉移酶的催化下結合到其他化合物上的過程。目前已發現的基因甲基化形式主要有DNA甲基化、RNA甲基化以及組蛋白甲基化，在多種生物學過程中發揮著重要的作用，包括基因的表達、干細胞的自我更新和分化、組織發育、RNA的穩定性等等。本文將從基因甲基化的概念、在腫瘤中的作用機制、檢測方法等方面做一綜述，為后續研究提供理論基礎。

1 甲基化的概念

1.1DNA甲基化 DNA甲基化是DNA甲基轉移酶(DNMT)介導的一種化學修飾過程，在DNMT催化下，通過S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基，將甲基轉移到相應堿基上。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在CpG島5′端胞嘧啶上，生成為5′甲基胞嘧啶[1]。CpG島為富含G、C堿基的DNA區域，主要位于基因的啟動子。人類的CpG以2種形式存在，一種分散于DNA中，另一種是CpG結構高度聚集的CpG島。在正常組織中，前者多被甲基化修飾，而后者常以非甲基化狀態存在于啟動子區[2]，大約有60%的人類基因存在于啟動子區的CpG島。在高等真核生物中已發現的DNMTs有：DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L[3]。DNMT1是一種維持甲基化的甲基化轉移酶，它能識別DNA復制時生成的“半甲基化DNA”，即其親代鏈已經甲基化，進一步促進子鏈形成新的甲基化CpG二核苷酸；DNMT3a和DNMT3b則主要在胚胎形成時期促進新的甲基化形成[4]。

1.2RNA甲基化 RNA甲基化一般是指m6A基因的甲基化。即堿基A第6位N原子上增加一個甲基。m6A主要存在于mRNA的CDS區(蛋白質編碼區)和3′UTR區，影響信使RNA(mRNA)的穩定性、翻譯效率、可變剪接和定位等，在后轉錄層面參與真核基因的表達調控[2]。

RNA甲基化在體內受到3種效應蛋白的調控，“書寫器”、“消除器”和“閱讀器”[2]。“書寫器”是指m6A甲基化轉移酶，介導RNA的甲基化修飾過程，主要指METTL3-METTL14復合物[5-6]，兩者可在體外和體內催化mRNA(和其他細胞核RNA)的m6A甲基化；另一種常見轉移酶是腎母細胞瘤1結合蛋白(WTAP)[7]；“消除器”是指去甲基化酶，介導RNA的去甲基化修飾過程，主要包括FTO[8]和ALKBH5[9]。“閱讀器”主要包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3[10]，可識別RNA甲基化修飾的信息，并參與下游RNA的翻譯、降解等過程。比如，YTHDC1可與mRNA上的m6A結合，將mRNA轉運出核。YTHDF1/YTHDF3識別m6A后可促進mRNA的翻譯，而YTHDF2與m6A的結合則會促進mRNA的降解。

2 甲基化與腫瘤

2.1異常DNA甲基化與腫瘤發生的關系 在腫瘤細胞中，常常有正常DNA甲基化模式異常改變，常表現為全基因組廣泛低甲基化及抑癌基因CpG島區域高甲基化；除此之外，基因錯配修復系統的失活、微小RNA(miRNA)表達缺失等均和DNA甲基化有著千絲萬縷的聯系。

2.1.1抑癌基因CpG島區域高甲基化 正常情況下，抑癌基因的CpG島為非甲基化狀態；而在某些腫瘤中抑癌基因啟動子區CpG島區域發生高甲基化，抑制了其轉錄和表達，使抑癌基因失活，導致腫瘤的產生。吳亮等[11]發現抑癌基因DACH1啟動子甲基化程度與食管鱗癌分化程度成反比，提示DACH1啟動子甲基化有很大可能促進食管癌的發生、發展。

2.1.2癌基因組的廣泛低甲基化 腫瘤細胞中常見全基因組的低甲基化會導致基因的突變率增加，特異基因尤其是啟動子區域的低甲基化則會激活癌基因，促進腫瘤生長及轉移[12]。

2.1.3基因錯配修復與DNA甲基化 DNA錯配修復系統(MMR)能夠修復幾乎所有堿基的錯配，最大程度避免基因突變。而有研究發現，當MMR缺陷時，CpG島會出現較強的甲基化[13]，堿基錯配將不能被修復，因此造成的基因突變也是腫瘤發生的機制之一。

2.1.4CpG甲基化促進腫瘤相關基因突變 研究證明，甲基化的CpG島基因突變的頻率遠高于正常水平。比如在結腸癌患者的p53基因中，55%左右的突變發生在CpG位點上，其中94%是C→T的突變，甲基化的CpG突變為TpG，經過DNA復制，最終從C∶G轉換為T∶A，導致遺傳信息的改變，最終可導致腫瘤的發生[14]。

2.1.5DNMT與腫瘤 作為DNA甲基化的催化酶，DNMT基因在異常甲基化中起著不可替代的作用。腫瘤細胞中某些部位基因的高甲基化往往預示著DNMT表達的增加，相反，DNMT表達的異常增加也可能導致部分基因尤其是抑癌基因的異常高甲基化，進一步促進腫瘤的產生。RAJNEESH等[15]發現，與乳腺干細胞相比，DNMT1在腫瘤干細胞中表達增加，而DNMT1基因的功能缺失則通過阻斷腫瘤干細胞的形成來保護小鼠免受乳腺腫瘤的影響。方欽亮等[16]采用免疫組織學技術檢測了89例手術切除肝癌組織與癌旁組織中DNMT1和DNMT3b的表達情況，發現肝癌組織中DNMT1和DNMT3b普遍存在過表達，且顯著高于癌旁組織，提示了這2種甲基化轉移酶與肝癌的發生和進展可能存在密切的關系。KIM等[17]對102例非小細胞肺癌進行研究，結果發現DNMT1和DNMT3b mRNA表達提高，同時檢出相關抑癌基因高甲基化。

2.1.6微小RNA(miRNA)編碼DNA甲基化與腫瘤 miRNA通過降解目標mRNA或抑制其翻譯從而實現對細胞生物學功能的調節。某些miRNA在癌旁組織和腫瘤組織中出現表達差異[18]，表現為表達增加或表達下降，羅順容等[19]采用實時熒光定量PCR法對27份非小細胞肺癌(NSCLC)組織及其癌旁正常組織標本的miRNA-205進行相對定量分析，發現肺鱗癌的miRNA-205表達水平升高，這可能與其編碼基因啟動子低甲基化有關；某些具有抑癌基因功能的miRNA的編碼基因啟動子區在癌癥中呈現出高甲基化狀態，而使其表達受到抑制[20]。

2.2RNA甲基化與腫瘤 近年來很多研究表明RNA甲基化與腫瘤的發生、發展密不可分，包括“書寫器”、“消除器”及“閱讀器”的異常都可導致腫瘤的產生與進展。有研究表明，包括METTL-3和METTL14復合體、RNA結合蛋白15等甲基化轉移酶復合物在髓系白血病中高度表達，它們的改變往往預示著預后不良，如m6A水平的升高可能預示著髓系白血病的發生[21]。除此之外，METTL-3和METTL14復合體還可影響某些信號因子活性來發揮其對腫瘤細胞的作用。研究表明mRNA甲基化可以通過調節蛋白激酶B(AKT)的活性促進子宮內膜癌細胞的增殖和致癌性，其機制之一就是METTL14熱點R298P的突變和METTL-3表達減少，導致AKT負調節器PHLPP2表達降低以及正向調節器mTORC2表達增高，導致AKT表達增加，而AKT又可促進細胞的存活和生長，進一步證實mRNA甲基化的降低可以增加子宮內膜癌細胞的增殖和致癌性[22]。

去甲基化酶的表達也與腫瘤關系密切，例如：低氧促進乳腺癌的表達，部分是通過增加去甲基化酶ALKBH5的表達，進而減少m6A表達水平來實現的[23]；有研究者也發現，在某些急性粒細胞白血病亞型中出現FTO的高表達，具體機制為：FTO基因促進細胞增殖或轉化和體外抑制細胞凋亡，而某些白血病相關致癌基因會使FTO的表達水平上調；使用MeRIP-seq測序法證實FTO過表達和敲除會分別降低和提升靶基因ASB2和RARA的m6A水平，進一步證實FTO可促進AML的發展，在AML中發揮著“原癌基因”的作用[24]。除此之外，免疫組化分析表明閱讀器YTHDF1表達與多種惡性腫瘤的行為有關，如腫瘤侵犯深度、淋巴結轉移、惡性腫瘤的分期，NISHIZAWA等[25]對結直腸癌患者生存期的研究表明，高YTHDF1表達的患者有顯著較差的總生存期，YTHDF1表達是影響患者預后的獨立危險因素，體外研究表明，敲除YTHDF1基因后，使用抗癌藥物氟尿嘧啶和奧沙利鉑等可抑制腫瘤的生長。

3 分子甲基化的檢測

3.1DNA甲基化的檢測 檢測基因組DNA甲基化水平的方法有很多，總體分為2大類：一類是檢測基因組總體甲基化水平，包括變性高效液相色譜法、基于抗5mC的免疫化學法、SssI甲基轉移酶法等，另一類方法則可檢測到具體的甲基化位點，例如甲基化敏感限制性內切酶-Southern印記雜交技術、重亞硫酸氫鈉修飾后測序法、甲基化特異性PCR、亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法等。

3.1.1變性高液相色譜法(DHPLC) DHPLC技術可對DNA甲基化進行定量檢測，由于異源雙鏈DNA和同源雙鏈DNA被色譜柱保留的時間不同，導致了DNA片段的洗脫特性差異。DNA片段的保留時間由DNA序列的G/C含量和存在的DNA失配來確定。序列中CpG位點的甲基化導致PCR產物的G/C含量比未甲基化基因組的含量增加，導致更高的熔融溫度，進一步增加了保留時間。在部分變性條件下，通過監測由硫酸氫鹽處理的DNA擴增子保留時間，可以揭示DNA甲基化的差異[26]。

3.1.2基于抗5mC抗體免疫化學法 利用5mC抗體能夠與5mC發生特異性反應：應用熒光素標記該抗體使之與預先已固定在DEAE膜上的樣品DNA特異性結合，對DEAE膜上的熒光素進行測量即可得到5mC的水平，熒光素強度與5mC水平成正比。抗體的設計決定了該方法的靈敏度和特異度。

3.1.3CpG甲基轉移酶(M.SssI)法 CpG甲基轉移酶(M.SssI)能識別雙鏈DNA上的CpG二核苷酸序列，并甲基化其中的胞嘧啶殘基。由3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)提供甲基，在M.SssI甲基轉移酶催化下轉移到基因組DNA的CpG胞嘧啶使其發生甲基化[27]。剩余腺苷甲硫氨酸(SAM)放射性強度與所測DNA甲基化水平成反比。但因M.SssI甲基轉移酶不穩定，導致結果不夠精確，可以用設置M.SssI甲基轉移酶自身對照組這一辦法解決。

3.1.4甲基化敏感的限制性內切酶-Southern印記雜交技術 甲基化敏感限制性內切酶只切割非甲基化DNA片段；而甲基化不敏感的限制性內切酶無論DNA片段是否甲基化都會切割。根據這一特性，將DNA分別用兩種內切酶切割，用放射性標記32P的探針對目的片段作Southern雜交。比較兩組條帶的差異即可得到目的位點的甲基化狀態。該法簡便、快捷，可定位具體甲基化位點。

3.1.5重亞硫酸氫鈉修飾后測序法[28]待測DNA片段中非甲基化的胞嘧啶經重亞硫酸鹽修飾后，轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，進一步通過高通量測序比較就可間接判斷樣品中的胞嘧啶甲基化與否。該方法分辨率高，可檢測出DNA序列上的全部甲基化信息，但費用較高。

3.1.6甲基化特異性PCR(MSP) 首先將DNA經亞硫酸氫鈉處理，其次進行PCR反應，針對經亞硫酸氫鈉處理后的甲基化或非甲基化DNA鏈設計出兩種引物對，若用前者能擴增出片段，說明該檢測位點發生了甲基化；若用后者能擴增出片段，說明該檢測位點沒有甲基化。王春華[29]通過實時熒光定量PCR法(RT-PCR)和測序法檢測支氣管肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化情況，發現RT-PCR與測序法檢測SHOX2和RASSF1A甲基化的一致率達到了99%和100%。該法具有較高的特異度、靈敏度，但待測序列需已知，引物設計不足或亞硫酸氫鈉對DNA處理不完全易致假陽性。

3.1.7重亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法(COBRA)[30]將亞硫酸氫鈉處理后的DNA進行PCR擴增，用限制性內切酶酶切PCR產物，后根據電泳條帶的不同位置及亮度即可檢測出DNA 的甲基化狀態及甲基化程度。JACOB等[31]應用COBRA與測序相結合(COBRA-Seq)檢測出在卵巢癌中GBGT1基因啟動子區出現高甲基化。該法簡便、可定量，避免了由甲基化敏感性酶產生的假陽性，但檢測位點受限，不能除外假陰性檢測的可能性。

3.1.8PCR熒光法 早在2000年，EADS等[32]就報道了采用熒光實時PCR的定量檢測DNA甲基化的技術，該方法基于Taqman?探針實時定量檢測。其中探針的設計是關鍵。首先由重亞硫酸鹽聯合限制性內切酶分析法檢測DNA甲基化狀態，其次設計與待測甲基化DNA位點互補的探針，探針的5′端連接上一個熒光報告寡核苷酸基團(6FAM)，3′端連接熒光淬滅寡核苷酸基團(TAMRA)，當探針與待測DNA雜交時，在PCR引物延伸至探針時，TaqDNA 聚合酶5′至3′外切酶活性會將探針5′端的熒光報告基團切下，3′熒光猝滅基團則不能再將其抑制，熒光報告基團釋放熒光即可被檢測，熒光強度和甲基化水平成正比。但該方法前提是待測DNA序列已知。

3.2RNA甲基化檢測方法 同DNA甲基化檢測方法相類似，RNA甲基化檢測同樣分為整體水平和精確到特異位點的檢測方法。整體甲基化檢測方法主要有LC-MS/MS(液相二級質譜法)；而MeRIP-seq、miCLIP以及SCARLET等方法則可明確甲基化位點，稍有不同的是MeRIP-seq法分辨率較低，為100堿基左右，而miCLIP和SCARLET法可精確到單堿基的程度。

3.2.1LC-MS/MS 在液相質譜的基礎上采用串聯質譜，能夠獲得分子離子峰和碎片離子峰，可對堿基同時進行定性和定量分析。將消化為單堿基的RNA樣本注入液相色譜儀，根據出峰的保留時間面積可計算各個堿基的含量；而后進入質譜串聯分析，將單個核糖核苷酸打斷成五碳糖和嘧啶或嘌呤，根據出峰的保留時間計算m6A的面積。最后根據m6A和總腺嘌呤的比例計算出m6A在mRNA上整體的甲基化程度。該方法可定量，且簡便、成本低，但不能對甲基化位點準確定位。

3.2.2MeRIP-seq/m6A-seq 該方法結合了免疫共沉淀和高通量測序的方法，用m6A特異性抗體篩選帶有m6A的mRNA片段并將其沉淀，構建相應的cDNA測序文庫，后進行高通量測序，對m6A甲基化程度較高的區域進行定位。該法可以以較高的精確度對全基因組進行測序，并得到較為精確的甲基化位點[33]。由于該方法的分辨率為100堿基左右，所以只能對大致的區域進行分析。

3.2.3miCLIP miCLIP是一種結合免疫共沉淀、共價交聯及高通量測序的技術[34]，它的基本檢測原理為：用紫外光誘導m6A抗體與含有m6A的RNA交聯，交聯后該RNA反轉錄得到的cDNA會出現C-T突變或者就此截斷，因此可以指示m6A的存在。

3.2.4SCARLET SCARLET法是一種結合了特定位點切割、放射性標記、“夾板”輔助提取以及薄層色譜法等多種技術的RNA測序法[35]。首先根據靶mRNA序列設計嵌合寡核苷酸，對目標核苷酸進行放射性標記；其次利用“夾板”輔助將嵌合寡核苷酸同待測RNA“結扎”在一起，后用RNA酶消化，待測序列因受“夾板”固定保護免受酶解，從而可被檢測。最后利用薄層色譜法分析具體修飾位點。該法分辨率高，但由于有放射性以及成本較高，使其開展受限。

4 展 望

DNA及RNA的甲基化修飾在腫瘤發生、發展中的重要作用已被大量專家學者研究所證實，其中DNA甲基化調控腫瘤的機制研究在近十幾年已日趨完善，某些研究較為成熟的基因已有商品化試劑盒流通，各種DNA甲基化抑制藥物推陳出新，為癌癥患者帶來了福音。相比之下，近幾年火熱的以m6A修飾為主的mRNA甲基化對腫瘤的調控機制研究還處于初期階段，因此各種mRNA m6A檢測技術成為推動其發展的重要手段，也為癌癥患者的早診、早治提供了新的方法。本文簡要介紹了兩種表觀遺傳學修飾與腫瘤的相互作用，以及相關檢測方法，希望能對甲基化領域初級研究者提供幫助。同時期待更方便、準確、快速以及經濟的檢測手段的出現，進一步提高檢測的特異度和靈敏度，從而更好地服務于臨床，推動表觀遺傳學在腫瘤早期診斷以及分期、預后和治療中的發展，為腫瘤患者帶來新的希望。