血流感染病原微生物診斷技術的研究與應用

章 波，伊貝拜汗·買賣提 綜述,張 新△ 審校

(1.新疆生產建設兵團醫院/石河子大學醫學院第二附屬醫院檢驗科，新疆烏魯木齊830002；2.石河子大學醫學院，新疆石河子832000)

血流感染(BSI)是一種發病率及病死率高的病原微生物全身感染性疾病[1]。研究表明，延遲、不足或不適當的抗感染治療與BSI患者病死率增加有關[2]。雖然在感染24 h內經驗性治療能改善患者預后，但可導致耐藥菌的出現和傳播，并增加侵襲性真菌感染的機會[3]。因此，正確且及時的抗感染治療對患者的生存和抑制病原微生物的耐藥性至關重要。BSI病原微生物的快速鑒定和藥敏試驗是臨床微生物實驗室最重要的任務之一，對于BSI病原微生物快速鑒定、藥敏技術的研究及臨床應用應引起檢驗人員的高度關注。本文討論了病原微生物診斷的最新技術研究，為促進BSI的診斷和治療提供新的視角。

1 基于血培養的病原微生物檢測技術

血培養仍然是BSI病原微生物診斷的“金標準”，但血培養儀陽性報警后，需分離純化病原微生物進行鑒定和藥敏試驗，因而導致報告結果周期長。目前，已有較多方法可快速鑒定陽性血培養中的病原菌，這些檢測方法簡化了常規血培養的工作流程，縮短了結果報告時間。

1.1陽性報警時間(TTP)的應用 TTP是指從血培養瓶放入監測系統到儀器報告陽性的時間。根據不同微生物在血培養瓶中生長速度的快慢，利用TTP可初步推斷微生物的類型。謝香梅等[4]統計大腸桿菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、腸球菌、鏈球菌及真菌等各有不同的TTP，結合革蘭染色可對BSI病原微生物類型進行初步鑒定。同時TTP對于鑒別分離菌株是否為污染菌具有一定的參考價值，朱珠等[5]對1 300例BSI分離菌株的TTP、實驗室數據及臨床資料進行綜合分析，并將這些細菌分為感染菌組與污染菌組，兩組比較TTP差異有統計學意義(P<0.05)。根據血培養瓶TTP的早晚可對病原微生物進行初步鑒定或判斷是否存在污染菌的情況等受諸多因素的影響，如抗菌藥物的使用、標本含菌量、取樣時間、取樣量等，因此其在臨床的應用仍有待于不斷研究。

1.2顯色培養基 顯色培養基是根據微生物自身代謝產生酶的特征而設計的一種分離培養基，通過直接觀察菌落顏色即可對菌株做出鑒定。目前，除了針對沙門菌、念珠菌屬、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、艱難梭菌、彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森菌等的特殊顯色培養基外，還有用于篩選耐藥性病原菌的顯色培養基，如耐萬古霉素腸球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐超廣譜β-內酰胺酶和碳青霉烯酶的腸桿菌等。將自動血培養儀與涂片鏡檢、顯色培養基結合起來，可縮短對血培養中陽性病原菌檢測時間。陳榮等[6]采用顯色培養基檢測血培養中MRSA，結果提示該方法與實驗室常規鑒定方法及聚合酶鏈反應(PCR)檢測結果的符合率高，特異度為98.8%，靈敏度為97.9%，同時該方法將實驗室診斷MRSA BSI的平均報告時間提前1 d。

1.3基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS) MALDI-TOF MS是依據微生物生物標志蛋白各自特異度肽質量指紋圖譜的不同，通過與商業化的參考數據庫進行比對，進而確定待測微生物的種屬。該技術對陽性血培養中病原菌分離純化后進行鑒定僅需幾分鐘，并且對臨床常見細菌鑒定準確率達到90%～95%[7]。對從陽性血培養中病原菌不分離純化直接鑒定而言，也僅需幾十分鐘，但該方法仍需探索以提高檢測的準確性。馬堅等[8]采用MALDI-TOF MS直接檢測312份陽性血培養中病原菌，與常規方法比較，屬水平鑒定符合率僅為84.0%，種水平符合率為64.7%，對革蘭陽性菌鑒定準確率不佳且低于革蘭陰性菌。MALDI-TOF MS對檢測病原菌耐藥性也有潛在的幫助，如檢測β-內酰胺酶或碳青霉烯類耐藥菌、檢測金黃色葡萄球菌耐藥基因及毒力因子以及區分萬古霉素敏感和萬古霉素耐藥腸球菌等[3]。盡管MALDI-TOF MS現已成為臨床實驗室鑒定微生物的有效工具，但依然存在諸多問題，如病原菌肽質量指紋圖譜重復性問題、質譜數據庫亟待完善及細菌耐藥性研究應用于臨床等均需要進一步改進和完善。

1.4熒光原位雜交(FISH)技術 FISH是一種利用熒光標記探針對不同病原微生物的rRNA分子進行靶向雜交的技術。該技術可用于金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌屬、鏈球菌屬、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、布魯菌屬和真菌等微生物的檢測。目前已有較多商業性試劑盒可用于直接鑒定陽性血培養中特定病原菌，如PNA-FISH?(AdvanDx)、Quick FISH?(AdvanDx)、The AccuProbe system?(Hologic)、Accelerate DiagnosticsTM(Arizona)等，這些均可在數小時內完成陽性血培養分離菌株的檢測，檢測的靈敏度和特異度可達到96%～100%[9]。一項多中心研究中，用肽核酸熒光原位雜交法(PNA-FISH)檢測陽性血培養中分離的355株腸球菌，檢測特異度和靈敏度分別為100%和97%[10]。盡管該技術在陽性血培養病原微生物檢測中表現出較好的應用前景，但可用的特異度探針數量有限，一些微生物只能在屬的水平上鑒定，并且缺乏所鑒定微生物的抗菌藥物敏感信息。

1.5核酸擴增技術 核酸擴增技術是一種體外擴增核酸片段的技術，以PCR技術最為常用，可從血液或陽性血培養中直接進行病原微生物鑒定及耐藥基因的檢測，具有較高的特異度和靈敏度[11]。該技術通常是使用特異引物擴增病原微生物目標基因或使用通用引物擴增細菌(16S/23S)或真菌(18S)基因組的保守rRNA區域，隨后對擴增產物進行凝膠電泳、高分辨率熔解曲線、微陣列雜交或基因測序等分析。MASEK等[12]使用PCR方法聯合高分辨率熔解曲線分析有效地檢出BSI中沙門菌。MOORE等[13]檢測1 130份疑似菌血癥患者血樣，采用PCR擴增病原菌16S和/或23S rRNA，然后進行焦磷酸測序，該方法與傳統培養法的一致性為96.9%，靈敏度為77.8%，特異度為99.3%。

由PCR衍變相關核酸擴增技術也廣泛用于BSI病原微生物檢測，如實時熒光PCR技術、多重PCR技術和環介導等溫擴增技術(LAMP)等。這些方法提高了PCR的靈敏度、特異度和檢測速度，更有利于BSI中多重病原微生物的檢測，同時也可對常見耐藥基因檢測，如mecA、vanA/B、vanC1/C2/C3、blaKPC、blaNDM-1、blaVIM或blaIMP等。胡翀等[14]采用多重PCR法鑒定200份陽性血培養標本，約4 h可完成細菌鑒定，與傳統血培養法結果符合率為100.0%；任春陽等[15]應用環介導等溫擴增技術直接檢測300份陽性血培養瓶中大腸埃希菌，檢出時間約1 h，與傳統培養法比較，靈敏度和特異度均達100.0%。

目前，已有較多基于PCR技術的商業性平臺應用于陽性血培養中病原微生物鑒定及耐藥基因的直接檢測，如FilmArray?(bioMérieux，France)、The GeneXpert?MRSA/SA BC assay(Cepheid，USA)、BD MaxTM StaphSR Assay(BD，Canada)、Cognitor?Minus(Momentum Bioscience，UK)和Eazyplex?(Amplex ByoSistems GmbH，Germany)等。雖然這些商業性平臺提高了檢測速度，但仍然無法擺脫PCR方法的局限性，如血液中PCR抑制劑及污染物DNA或死亡微生物的DNA的存在等影響檢測結果；在病原菌未明的情況下，難以做到逐一檢測用于BSI多重病原菌感染的診斷。其次，在國內實驗室推廣應用上也受多種因素限制，如基層實驗室條件限制、PCR試劑盒診斷價格和某些技術平臺國內批準文號等。

1.6基因芯片(DNA微陣列) DNA微陣列由固定在固體表面特異度DNA探針組成，通過識別待分析靶DNA與陣列雜交的熒光信號從而對多種病原微生物進行檢測，同時該技術也用于檢測耐藥基因和基因分型。目前，DNA微陣列可檢測90%～95%已知導致BSI的病原菌，靈敏度范圍為101～105個細胞/mL，適用于陽性血培養中病原微生物檢測[16]。

已有用于臨床陽性血培養中病原微生物檢測的商品化基因芯片，如Prove-itTMSepsis (Mobidiag，Finland)可在3.5 h內檢測60種細菌和30種真菌，并且可檢測mecA、vanA、vanB耐藥基因，靈敏度和特異度分別達到95.0%和99.0%[17]，但該商品盒目前已停產。另一種是美國食品和藥物管理局(FDA)批準基于DNA微陣列的Verigene?系統(Nanosphere，USA)，該系統用于檢測12種革蘭陽性菌以及相關耐藥基因(mecA、vanA和vanB)和另外9種革蘭陰性細菌(1種未經FDA批準)及其耐藥基因(blaNDM、blaVIM、blaKPC、blaOXA和blaCTX-M)，可在2.5 h內直接從陽性血培養中識別細菌及其相關耐藥基因，靈敏度為92.6%～100.0%，特異度94.3%～100.0%[18]。然而，昂貴的基因芯片及檢測儀器嚴重限制了這種技術的臨床普及與應用。

1.7綜合檢測平臺 近年來，結合不同的分子生物學技術而開發的綜合檢測平臺已用于臨床陽性血培養中病原微生物直接檢測。如Sepsis Flow Chip (Master Diagnostica，Spain)利用多重PCR和低密度DNA微陣列技術，可在3 h內同時檢測36種細菌、念珠菌屬(白色念珠菌和其他念珠菌屬)和20種耐藥基因。GALIANA等[19]對該檢測方法進行性能評價，細菌鑒定的靈敏度和特異度分別為93.3%和100.0%，檢測耐藥基因的靈敏度和特異度分別為93.6%和100.0%；The ePlex?system(Carlsbad，USA)全自動多重分子診斷系統，結合多重PCR擴增和數字微流控技術，可在1.5 h內檢測41種細菌、16種真菌和10種耐藥基因(blaNDM、blaVIM、blaKPC、blaOXA、blaCTX-M、blaIMP、mecA/C和vanA/B等)，與實驗室常規方法比較，該檢測系統檢測真菌、革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的一致性分別為100.0%、97.8%和97.8%[9,20]。綜合性檢測平臺診斷性能上具有較好的優勢，但仍需進一步研究以獲取可靠數據，同時也需綜合考慮其臨床效益。

2 基于全血標本的病原微生物檢測技術

從疑似BSI患者血液樣本中直接檢測病原微生物的技術，因無需進行血培養而有可能顯著縮短檢測時間。已有較多基于全血標本的快速病原微生物檢測技術，如基于PCR技術、MALDI-TOF法、宏基因組學、基于聲學分離的集成微系統和微芯片法、基于表面等離子體共振成像儀與抗體微陣列耦合的無標記方法、基于微流控分離細菌方法、基于T2磁共振(T2MR)法等[3]。在這里，筆者討論最近可應用于臨床的商業性平臺和直接從全血診斷BSI的方法。

2.1PCR技術 目前，傳統PCR方法以及PCR衍變的相關核酸擴增技術在直接檢測血液中病原菌及其耐藥基因中均有報道。同時也出現了較多商業性平臺或試劑盒，如LightCycler?SeptiFast Test (Roche，Germany)、SepsiTest(Molzym，Germany)、Magicplex?Sepsis Real-time Test(Seegene，Korea)和Vyoo?(Analytik Jena，Germany)等，這些均可顯著縮短檢測時間，并逐步應用于臨床BSI診斷之中。如應用廣泛的LightCycler?SeptiFast Test平臺，該系統可直接檢測全血標本中25種病原體(10種革蘭陰性菌、9種革蘭陽性菌、6種真菌)，整個過程需4～6 h[21]。然而這些商業性平臺或試劑盒仍需經過臨床驗證才能進行推廣，一項薈萃分析顯示，SeptiFast法與培養法比較，靈敏度和特異度分別為68%和86%，因此其特異度和靈敏度仍有待提高[22]。

與直接從陽性血培養中檢測病原微生物相比，采用PCR技術直接檢測全血標本具有獨特的優勢，如檢測生長緩慢及無法培養的微生物、處理接受過抗菌藥物治療的血樣或抽血量較少的血液樣本等。但是該方法更易造成假陽性結果，未感染時血液中存在的死細菌/真菌DNA或者有效抗感染治療后血液殘存的致病DNA等均可影響檢測。總的來說，由于檢測成本高、檢測過程標準化和結果解釋困難、靈敏度和/或特異度有限等嚴重影響了PCR方法直接檢測BSI全血標本的臨床應用。

2.2PCR-電噴霧離子質譜法(PCR ESI-MS) PCR ESI-MS通過PCR擴增及電噴霧離子質譜(ESI-MS)檢測PCR擴增產物，然后將其與數據庫進行比較以確定檢測的微生物。研究表明，該方法可直接用于全血標本中病原微生物檢測，與傳統培養法的總體一致性為77.1%，靈敏度為50.0%，特異度為93.8%；而采用該方法直接檢測陽性血培養中病原微生物時，與傳統培養法總體一致性為94.2%，靈敏度為96.8%，特異度為98.5%，因此優選用于陽性血培養檢測[23]。

最近，已經開發了用于全血標本中病原菌及耐藥基因的PCR ESI-MS檢測平臺。如雅培公司的IRIDICA系統允許6 h內鑒定約800種微生物及4種耐藥基因(mecA、vanA、vanB、blaKPC)[24]。對疑似BSI患者中300份全血標本進行的前瞻性研究發現，采用該系統與常規血培養法總體一致性為86%，靈敏度為76%，特異度為90%[25]。由于該方法檢測結果需根據醫學圖表進行解釋，并且無法確定抗菌藥物耐藥表型。因此，PCR ESI-MS測定應被視為輔助而不是取代常規培養的方法。

2.3宏基因組學 宏基因組學是對樣本中特定或所有遺傳物質的基因組分析。目前，對宏基因組測序主要有傳統的Sanger/鳥槍法和高通量測序技術(又稱二代測序技術)。這些方法已成功應用于陽性血培養或全血標本中細菌鑒定，與傳統培養法相比具有相同或更高的靈敏度[26]。一項多中心研究顯示，比較二代測序與常規微生物方法對101例免疫功能低下患者感染診斷價值，該方法具有更高的陰性預測值，并且可檢測到更多的臨床相關病毒和細菌[27]。此外，宏基因組學可以檢測耐藥基因和毒力基因，并提供有關分子流行病學的重要信息。

目前，基于宏基因組學方法僅開發了一種可用于血液或血液制品的商業性系統：The iDTECTTMDx Blood test (PathoQuest SAS，France)，該系統利用二代測序技術，從單個血液樣本中可識別超過1 200種臨床相關的細菌和病毒[9]。目前，由于數據庫限制、檢測樣本的高成本以及質量控制復雜等問題阻礙了該技術在臨床微生物實驗室的引入。

2.4基于T2磁共振(T2MR)方法 T2MR是一種微型的、基于磁共振的診斷技術。該方法主要過程包括PCR擴增病原微生物特異度DNA，然后將擴增產物雜交到探針修飾的超順磁性納米顆粒上，最后用磁共振技術檢測。T2Candida?Panel(T2Biosystems，USA)是FDA批準的基于T2磁共振檢測真菌試劑盒。該試劑盒能夠在3～5 h直接從全血中鑒定出5種念珠菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌)，無需提取DNA，最低檢測限為1 CFU/mL[28]。一項多中心研究顯示，采用該方法直接檢測全血標本中病原菌的靈敏度和特異度分別為99.4%和91.1%[29]。最近，T2 Biosystems推出了T2Bacteria?Panel，能在3～5 h內檢測引起BSI的6種常見細菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌)，但尚未公布任何性能數據。

3 小 結

BSI的快速病原菌鑒定和藥敏試驗可以減少治療時間和改善患者預后。面對日益嚴峻的抗菌藥物耐藥性威脅，能夠在幾小時內確定BSI病原菌的快速診斷方法，有望成為BSI治療及抗菌藥物管理最有效的方法。目前，大多數方法依賴于陽性血培養后進行細菌鑒定，但仍為一些不可培養的病原菌留下檢測缺口。而直接從患者血液進行檢測病原菌的方法可能對顯著縮短BSI診斷周轉時間更有潛力，但其檢測的靈敏度和特異度仍然是一個挑戰。隨著對各種新技術研究的深入，一些技術逐漸從研究階段應用于臨床，但理想的BSI病原微生物檢測技術不僅應該能快速確定病原菌，更重要的是確定其抗菌藥物靈敏度信息。迄今為止對抗菌藥物靈敏度的測定仍然取決于對分離菌株的藥敏分析，因此能夠快速、準確地鑒定BSI病原菌及同步獲得藥敏信息的新方法仍需不斷探索。