調控自噬在臨床肝病治療性應用的轉化研究

汪艷

作者單位：510515 廣州 器官衰竭防治國家重點實驗室，廣東省肝纖維化工程技術研究中心，南方醫科大學肝病研究所

自噬是真核細胞的一種進化保守的分解途徑，始于細胞器吞噬，終于溶酶體。自噬對維持器官穩態有重要作用，參與抗衰老和免疫反應等機制[1]。很多疾病存在自噬異常，如肥胖、2型糖尿病、炎癥和感染性疾病、神經退行性病變以及腫瘤等[2]。哺乳動物細胞的自噬作用主要有三種：大自噬、小自噬以及分子伴侶介導自噬。一些非經典自噬也陸續被發現。本文內容主要涉及大自噬(以下稱為自噬)。

一、自噬的基本分子過程和生理功能

自噬始于自噬小體形成。自噬小體形成過程中，部分細胞質(其中也許有細胞器、蛋白聚合體、脂滴等)成批或選擇性地被捕獲。選擇性捕獲的自噬有多種，如線粒體自噬、內質網自噬、外來入侵微生物異物自噬。發生選擇性自噬時，自噬適配分子會專門將吞噬對象靶向運送到自噬小體的囊膜上，發生泛素依賴或非依賴性的捕獲作用。然后，自噬小體沿著微管運輸吞噬物至溶酶體進行降解。自噬作用依賴自噬相關基因(ATG)蛋白和由第三類磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3P)、Beclin-1以及ATG14L組成的復合物的活性。這個復合物可以產生PI3P，PI3P是自噬小體形成所需的。自噬小體成熟為自噬溶酶體還要依賴某些ATG蛋白分子、Rab GTP酶的活性、系連分子和適配分子，以及SNARE分子等完成融合過程。

在肝細胞中，自噬作為對饑餓的反應，通過溶酶體降解自噬物，會形成氨基酸、碳水化合物以及脂肪酸再循環入胞質。自噬可以去除錯位折疊蛋白和受損細胞器，協助胞質質量控制，維持肝組織穩態。自噬還有脂質吞噬作用，參與脂質代謝。

二、自噬對肝臟疾病的干預策略和干預方式

涉及治療肝病的干預策略可以從三方面考慮：首先，自噬基因和溶酶體分子表達的上游轉錄因子；其次自噬小體形成起始階段的吞噬泡聚集(或膜分離)、延伸和成熟，以及自噬小體閉合等環節；最后成熟階段的自噬小體與內溶酶體囊腔融合，溶酶體水解酶的活性，以及營養物從溶酶體循環至胞質等環節。

干預方式可以采取：(1)遺傳性干預，如選擇性過表達某些ATG蛋白、轉錄因子TFEB調控自噬和溶酶體生成；(2)藥物干預，包括使用自噬抑制劑如3-甲基腺嘌呤(3-MA)，ATG活性特異性抑制劑如ULK1或ATG4B，TFEB激活劑如ezetimibe，以及目前最廣泛用于以調控自噬為目的的臨床研究的雷帕霉素及類似物和氯喹及其衍生物；(3)營養性干預，如限制熱量攝入，或者增加自然來源營養物質激活自噬；(4)多通路干預，即聯合應用以上干預方式。

三、臨床肝病治療的應用分析

(一)急性肝衰竭(ALF)

喪失自噬作用會在動物模型誘發自發性肝腫大和肝損傷。通過使用自噬激活劑或誘導ATG5表達，這些變化可以恢復。自噬在應激性肝損傷中有限制肝細胞死亡的作用。

1．對乙酰氨基酚(APAP)過量 APAP過量是ALF常見原因。APAP過量會引起肝細胞自噬增加，以清除受損線粒體。雷帕霉素激活自噬，有一定保護作用，而使用氯喹或者去除ATG7阻止自噬會加重肝損傷。自噬保護作用還有賴于APAP蛋白質胼合物形成。無菌性炎癥由炎癥小體依賴性IL-1β釋放介導，也參與了APAP肝損傷。線粒體損傷可能是炎癥小體激活的原因。自噬去除受損線粒體有助于避免炎癥小體過度活化。

2．死亡受體介導肝損傷 死亡受體介導肝損傷常見于病毒性肝炎、急性酒精性肝炎以及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。自噬的保護作用包括：自噬可以直接抑制肝細胞中caspase 8；巨噬細胞中發生p62依賴性線粒體自噬可以限制NF-κB介導炎癥和炎癥小體依賴性IL-1β的產生。

3．缺血再灌注(I/R)肝損傷 隨缺血類型(熱、冷)、實驗模型，以及所用保存液類型等的不同，自噬在I/R損傷中的作用有不同報道。而且還沒有評價體內自噬作用的準確數據。

4．轉化策略 實驗研究顯示自噬有肝保護和抗炎作用，提示使用自噬活化劑藥物可能是一種治療策略，尤其在APAP肝損傷的情況下，但是否可用于I/R損傷還需要更多研究。

(二)遺傳性肝病

1．Wilson’s病(WD) 自噬可以對抗WD引起的銅毒性。在WD患者肝臟、ATP7/B缺陷的小鼠模型，以及沉默了ATP7B并暴露于CuCl2的肝細胞株，自噬會增加。用自噬特異性抑制劑spautin-1阻斷自噬，會加重體外和體內模型肝細胞死亡、線粒體損傷和氧化應激。而如果通過饑餓或過表達TEFB激活自噬，則可以促進肝細胞存活。能否使用自噬活化劑對抗WD銅毒性還需要繼續探索。這一作用能否擴展到其他金屬相關肝病，如血色素沉著病也值得觀察。

2．α-1抗胰蛋白酶(α1-AT)缺陷病α1-AT 缺陷患者會出現含ATZ自噬小體聚集增多。ATG5敲除細胞表現出ATZ降解遲緩。提示自噬對降解ATZ有重要作用。然而僅降解還不足夠，相當部分ATZ頑固地存留在包涵體里，對肝細胞產生毒性，引起肝損傷和肝纖維化。幾項臨床前研究顯示，誘導自噬可以改善α1-AT 缺陷引起的肝損傷和纖維化。肝細胞TFEB轉基因治療α1-AT 缺陷小鼠模型，可以明顯減少肝臟中ATZ、肝細胞凋亡和纖維化。用卡馬西平活化自噬也出現類似效果。雷帕霉素或熊去氧膽酸也顯示有益作用。一項II期臨床試驗成人α1-AT 缺陷相關肝硬化患者正在進行使用卡馬西平 52周治療觀察(NCT01379469)。

對毒性蛋白或金屬在胞內過度聚集引起的病變，活化自噬也許是一個可以考慮的治療策略。

(三)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

自噬通過脂質吞噬可以對抗肝細胞脂肪變，通過肝細胞的線粒體自噬和巨噬細胞的抗炎作用具有護肝作用，從而緩解肝病進展。

自噬受到NAFLD相關多種病理因素影響而減弱。在NAFLD動物模型和患者中都發現自噬水平是降低的。在NASH患者和小鼠，ATG蛋白和TFEB表達下降，而p62和自噬抑制分子Rubicon的表達則升高。與NAFL和肝臟正常者相比，NASH患者肝竇內皮細胞的自噬水平下降。如小鼠肝臟細胞中自噬通路的相關分子被敲除，或者將小鼠暴露于3-MA，給予高脂飲食飼養會引發小鼠嚴重NAFLD。表現為肝細胞脂肪變和Mallory-Denk小體增多，肝細胞損傷加重，內質網應激和炎性因子生成增加。相反，如敲除自噬抑制分子Rubicon或腺病毒轉染ATG7，小鼠模型的脂肪變和肝損傷改善。近期數據顯示，線粒體自噬受損也參與形成NAFLD肝損傷，以及形成巨大線粒體。但是，自噬通路成分對肝細胞脂肪變形成的確切作用目前還有爭議。

NAFLD治療目前仍以干預生活方式為主，包括控制飲食和改變體力活動。限制熱量攝入和運動也是兩種重要的自噬活化方式。用二甲雙胍或二糖四已聚糖靶向AMPK，或使用咖啡因增強脂質自噬和β-氧化作用，也顯示抗脂質生成作用。另外，使用TFEB激動劑或肝細胞TFEB過表達，在高脂飲食小鼠模型可以通過自噬對抗脂肪變發生。地高辛、斑霉素和己聯雙辛胍可以促進TFEB入核，活化自噬，改善高脂飲食小鼠模型脂質代謝、胰島素耐受和脂肪變。最近還發現巨噬細胞TFEB過表達可以誘導自噬、降低IL-1β生成。因此可以繼續觀察TFEB激動劑是否減輕NASH進展相關的炎癥反應。TFEB激動劑ezetimibe是NPC1L1依賴性膽固醇轉運抑制劑。使用ezetimide和四已聚糖可以抑制巨噬細胞中NRLP3-依賴的IL-1β生成。ezetimide可以減輕NASH損傷，四已聚糖則在實驗模型表現出血管保護作用。值得一提的是這些都是FDA已經獲批的藥物，ezetimide已經開始用于NASH臨床試驗。

NAFLD會發生自噬失調。靶向自噬似乎有治療前景。值得注意的是，相關藥物的作用是否完全是因自噬相關作用引起尚需要闡明。有必要進一步研發具有自噬特異性的治療藥物。

(四)肝纖維化

自噬對纖維化的作用比較復雜，依賴于細胞類型。

1．星狀細胞(HSC) 活化HSC的自噬會增加。自噬在HSC向肌成纖維細胞轉化過程發揮了重要作用。自噬促進了靜止狀態HSC中脂滴消化，自噬促進脂酶代謝視黃酯為游離脂肪酸，進行線粒體β-氧化，增加ATP水平。敲除HSC的ATG5或ATG7，可以對CCl4和TAA誘導肝纖維化有抵抗作用，HSC活化水平也會降低。內質網應激、氧化應激等通過增加自噬、活化HSC，導致纖維化加重。此外，自噬底物p62下調可能是HSC活化的另一機制。敲除HSC的p62會加劇α-SMA和COL1A1的表達。與野生型小鼠相比，HSC特異性敲除p62的小鼠模型更容易發生纖維化。

2．肝細胞和內皮細胞 肝細胞凋亡是啟動和維持纖維化發生過程的中心事件。自噬可以為肝細胞提供生存信號，可以被看作抗纖維化作用。老年小鼠敲除肝臟ATG會發生自發肝纖維化，這是由于蛋白毒性和促/抗凋亡蛋白穩態被擾亂而造成的。選擇性干擾ATG或ATG7會破壞內皮細胞表型，當給予小鼠CCl4或持續高脂飲食易引發肝損傷、炎癥和纖維化。

3．巨噬細胞 在各種來源巨噬細胞，自噬可以降低IL-1β生成，阻礙HSC的存活和促纖維化作用通路，可以被看作抗炎作用。ATG敲除的庫普弗細胞與HSC共培養可以增加HSC的纖維化發生能力。使用IL-IR抗體可減弱這個作用。較野生型小鼠，髓樣細胞系缺失ATG5小鼠，肝IL-1β表達會增加，也更容易發生肝損傷和纖維化。靶向自噬應考慮針對專有細胞類型。

(五)肝細胞癌(HCC)

HCC產生于多種信號通路的體細胞突變組合。自噬與這些通路相互作用，對HCC發生、發展有雙向影響。

1．自噬阻止HCC發生 自噬維護細胞內部穩態，抵御腫瘤發生。去除Beclin-1、ATG5或ATG7破壞自噬，可以促進年老小鼠自發肝腫瘤，還會引起p62聚集。p62聚集一方面通過結合KEAP1阻止NRF2的抗氧化作用，另一方面通過與NF-κB、PI3K/Akt/mTOR和/或Wnt-β-catenin對話促進腫瘤發生。Yap過表達參與了肝癌發生的早期事件，自噬會增加Yap降解。

2．自噬促進HCC進展 自噬在已經形成的HCC中是增加的。腫瘤細胞通過自噬獲得更多能量，提高在低氧、低營養環境條件下的生存能力。自噬還可以通過促進上皮間質轉分化，使腫瘤細胞獲得侵蝕能力。自噬分子LC3和Beclin-1在多項研究中被發現有預后意義。

至今還沒有聯合傳統HCC治療進行自噬調節的臨床數據。但是臨床前研究顯示，自噬有治療靶標的潛力，如靶向殘余腫瘤細胞抑制自噬可能有助于治療，聯合使用自噬抑制劑可以提高腫瘤對sorafenib的治療反應。然而產生有效的抗腫瘤T細胞反應需要自噬，將自噬活化劑聯合免疫檢查點抑制劑也許可以激發抗腫瘤免疫反應。

(六)酒精性肝病(ALD)

自噬參與ALD的情況比較復雜，在急性飲酒與慢性飲酒的數據有所不同。

1．急性飲酒急性飲酒時，乙醇會導致過氧化物產生增加、內質網應激、脂質生成和線粒體改變。乙醇還可以抑制mTOR1復合物，引起ULK1活化，增加FoxO3a核轉移，從而提高很多自噬相關基因的表達。急性飲酒還會提高TFEB的核內水平。由此，自噬對急性飲酒是肝保護性的，它通過降解受損線粒體和脂滴，減少肝細胞凋亡和脂肪變。

2．慢性飲酒 慢性酒精飼養的小鼠模型肝臟中自噬小體數量增加，然而溶酶體數量卻因乙醇作用而下降，這影響到自噬動態變化。溶酶體數量衰減與TFEB核聚集減少以及溶酶體功能受損相關。過表達TFEB可以逆轉酒精對溶酶體生成的破壞作用，小鼠對脂肪變和肝損傷的抵御能力相應增加。另一種可能機制是sGTP Rab7失活和dynamin2活性降低，造成溶酶體耗竭和脂質吞噬抑制。

臨床前數據顯示，使用卡馬西平或雷帕霉素提高自噬，可以減輕ALD小鼠模型的肝脂肪變和肝損傷。由于NASH和ALD共有一些病理特點，有可能在NASH驗證有效的自噬靶向治療在ALD也可以進行評價。

四、應用轉化研究的挑戰

為進一步開展臨床試驗、廣泛測試自噬調控作用，有幾點需要引起注意[3]。首先，進一步分析肝病自噬調節通路的特點，對尋找可靶向的自噬特異性調控環節是必要的。第二，尋找自噬標志物和測量體內自噬動態變化的方法，對于開發自噬靶向策略非常重要，而且還要考慮到疾病特異性。第三，尋找慢性肝病的最佳治療時間窗也是必須的，因為在肝病不同進展階段，自噬的類型和程度可能也有變化。第四，技術策略最好是特異靶向某種細胞，減少對其他細胞的影響。最后，使用量和頻次需要仔細界定，因為過度活化自噬可能是破壞性的，自噬調節劑的治療效果可能也只有通過間歇治療達到。而且肝臟自噬存在晝夜節律現象，應該作為優化治療的一個考慮因素。