腸道微生態與慢性肝病研究進展

盧峪霞 楊長青

隨著近年來宏基因組學和代謝組學的進步，發現了腸道微生態在很多疾病發生、發展中的作用，最新的文獻總結了腸道菌群在調節宿主生理及病理變化中的作用，并將焦點集中于腸—肝軸[1]。Marshallpo[2]于1998年正式提出了“腸-肝軸”的概念。由于腸道菌群失調及其他因素的影響，導致肝功能異常、肝脂肪變性和結締組織重塑等慢性肝病進展，其中有炎癥介質、細胞因子、氧化應激、線粒體功能紊亂等參與。腸道屏障功能被破壞時，腸道滲透性增加導致腸衍生細菌產品如脂多糖(LPS)的易位，刺激toll樣受體(tlr)，激活庫普弗氏細胞、內皮細胞、樹突細胞、膽道上皮細胞、肝星狀細胞，導致肝纖維化，引起慢性肝病[3]。越來越多的研究表明腸道微生物群失調與各種肝病有關，如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝硬化、自身免疫性肝病和肝癌等。腸道微生態與慢性肝病之間的關系，成為了新的研究熱點，本文對近年來這方面最新進展作一綜述。

一、 腸道微生態與慢性病毒性肝炎

腸道微生物群的變化在誘導和促進乙肝病毒引起的慢性肝病進展方面起到了重要的作用。為闡明慢性乙肝早期腸道微生物的組成、功能特征，及其在疾病進展中的影響，有學者[4]入組85名低Child-Pugh scores慢性乙型肝炎患者及20名健康對照，收集糞便樣本，應用 Illumina MiSeq 測序平臺進行菌群鑒定，發現與對照組比較，慢乙肝組腸道菌群有以下顯著變化：5個物種操作單元(operational taxonomic units, OTUs)增加，包括Actinomyces、Clostridium sensu stricto、unclassified Lachnospiraceae和Megamonas；27個OTUs減少，包括Alistipes、 Asaccharobacter、Bacteroides、Butyricimonas、Clostridium IV、 Escherichia/Shigella、Parabacteroides、 Ruminococcus、unclassified Bacteria、unclassified Clostridiales、Unclassified Coriobacteriaceae、 unclassified Enterobacteriaceae、unclassified Lachnospiraceae和unclassified Ruminococcaceae等。

另有研究在患有乙型肝炎病毒感染的患者中，應用定量PCR和免疫學技術，研究糞便參數，包括糞便占主導地位的細菌數量，以及從大腸桿菌、脆弱擬桿菌、梭狀芽胞桿菌、產氣莢膜梭菌以及一些免疫學參數[5]。數據分析表明，16 S rRNA基因拷貝數為柔嫩梭菌、糞腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌(乳酸菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬)，在乙肝肝硬化患者的腸道中顯示出明顯的變異。雙歧桿菌和腸桿菌科(B/E)比值，表明腸道菌群的定植抗力，從健康對照組(1.15±0.11)、無癥狀攜帶者(0.99±0.09)，慢性乙型肝炎患者(0.76±0.08)，到肝硬化失代償患者(0.64±0.09)依次顯著降低(P<0.01)；表明(B/E)比值可以反映肝臟疾病進展過程中腸道微生態的失調。致病基因增加表明在肝臟疾病惡化過程中，致病因子的多樣性增加。在失代償乙肝肝硬化患者中，糞便SIgA和腫瘤壞死因子的水平高于其他組，表明機體試圖通過復雜的自我調節系統達到新的腸道微生態平衡。

我國學者[6]設計了一項通過糞菌移植(FMT)治療經過長期NA治療后HBeAg仍未轉陰的慢性乙型肝炎患者的病例對照、開放標簽的前瞻性研究。該研究納入了18例經恩替卡韋或替諾福韋治療3年以上但仍未實現HBeAg消失的慢性乙型肝炎患者?；颊咴诶^續接受抗病毒治療的同時，5例接受了FMT，13例作為對照。FMT治療組患者接受經胃鏡FMT治療，每4周1次，直到HBeAg消失。4例患者接受了1～7次治療，1例患者在第5次FMT治療后退出了試驗。隨訪結束時，FMT組患者的HBeAg滴度較基線水平有顯著下降，且每次FMT治療后逐步下降。2例患者在接受了1次FMT后即實現HBeAg清除，還有1例在2次FMT治療后清除HBeAg。相反，對照組沒有1例患者清除HBeAg。

最近研究表明[7]，腸道微生物群的改變可能與丙型肝炎病毒誘發慢性肝病(CHC)的發病機制有關。HCV患者腸道微生物群的組成在肝臟疾病階段是穩定的，不同于非酒精性脂肪肝、乙型病毒性肝炎、艾滋病毒和丙肝病毒共同感染患者的腸道微生態的不穩定性。丙型肝炎病毒感染對腸道滲透性的影響，可導致腸道菌群失調開始、進行以及促炎作用，直至發展成肝硬化和肝癌。根除HCV消除了腸道微生物群不平衡對肝臟疾病發展的影響，并可能對益生菌的使用產生影響，從而改變肝硬化進展的自然歷史。

二、 腸道微生態與肝炎肝硬化

Wei等[8]招募了120名乙肝肝硬化患者和120名健康對照組患者，通過對完整的元基因組DNA和生物信息學方法的高通量測序，對20例乙肝肝硬化患者及20個健康對照組進行了比較，分析了糞便微生物群落和功能。發現兒童Child-Turcotte-Pugh 評分和擬桿菌(P<0.01)呈負相關，而和腸桿菌科及韋榮氏球菌呈正相關(P<0.01)。對另外200個糞便微生物群樣本的分析表明，腸道微生物標記可能有助于區分正常人群和肝硬化患者。與對照組相比，在肝硬化患者的糞便微生物群功能多樣性顯著降低。肝硬化病人的糞便微生物群顯示在谷胱甘肽、糖異生、支鏈氨基酸、氮和脂質的代謝方面增加(P<0.05),而芳香族氨基酸、膽汁酸的代謝以及與新陳代謝相關的細胞周期減少(P<0.05)。研究提示肝硬化患者糞便微生物群有廣泛差異和代謝潛力，腸道微生物群落可以作為調節人體新陳代謝平衡的獨立器官，并影響肝硬化患者的預后。

三、 腸道微生態與酒精性肝病

研究者[9]對在兩種不同的動物設施中的ALD進行了不同的處理，以測試兩種互補策略(糞便微生物群移植和益生菌治療)的有效性，以逆轉不正常生活和防止ALD的發生。在兩種不同的動物設施中，老鼠被喂食酒精，并使用Lieber DeCarli的飲食(一種酒精性脂肪肝造模飼料)。用對酒精抵抗的供體老鼠的新鮮糞便移植到對酒精敏感的老鼠，每周三次。另一組老鼠在喂食酒精期間給予了果膠。結果顯示：對酒精敏感的小鼠，酒精引起脂肪變性和肝臟炎癥，與腸道內穩態破壞有關，對酒精抵抗的小鼠則不然。腸道菌群分析表明，在酒精敏感的小鼠中，擬桿菌屬的比例顯著減少(P<0.05)。分析顯示，酒精敏感和抵抗小鼠的腸道菌群聚集方式不同。果膠療法引起了對腸道菌群的重大改變，糞菌移植可以使對酒精敏感的小鼠與酒精抵抗小鼠的腸道菌群非常接近，這兩種方法都防止了脂肪變性、炎癥和恢復腸道內穩態。提示對酒精性肝病的敏感性是由老鼠的腸道微生物群引起的，可以用酒精抵抗的供體老鼠糞菌移植到對酒精敏感的老鼠或用益生元來治療酒精誘發的肝損傷。

有研究證實腸道微生物群會影響個體對酒精性肝病的易感性[10]：接受嚴重酒精性肝炎患者糞菌移植的老鼠比接受沒有酒精性肝炎的酗酒者糞菌移植的老鼠出現更嚴重的肝臟炎癥、肝T淋巴細胞亞群和自然殺傷T淋巴細胞(NKT) 數量增加、更多的肝細胞壞死、腸道通透性增加和更多的細菌易位；同樣，CD45+淋巴細胞在內臟脂肪組織中增加，在腸系膜淋巴結中CD4(+)T和NKT淋巴細胞增多；嚴重酒精性肝炎和無酒精性肝病的腸道菌群的細菌豐度和成分存在差異；嚴重酒精性肝炎的腸道菌群主要是有害細菌，而無酒精性肝病的腸道菌群主要是腸球菌屬，熊去氧膽酸也更豐富。提示個體對ALD的敏感性在很大程度上是由腸道菌群驅動的，因此可以通過調節腸道菌群來預防和管理ALD。

為研究益生菌(培養乳酸菌/鏈球菌)對酒精性肝炎治療的影響，一項隨機對照的多中心研究提示7 d口服補充乳酸菌、鏈球菌可以重建腸道菌群和改善患者的內毒素(LPS)水平[11]。從2010年9月到2012年4月，有117例患者(益生菌60和安慰劑57)被前瞻性隨機分配，接受7 d的培養乳酸菌/鏈球菌(1 500 mg/d)或安慰劑。通過糞便培養，對肝功能試驗、促炎細胞因子、LPS和菌落形成單位進行了研究和比較。結果顯示兩組中天冬氨酸轉氨酶/丙氨酸轉氨酶、堿性磷酸酶、谷氨酰轉肽酶、膽紅素、凝血酶原時間均顯著改善。在益生菌組(基線和之后)，白蛋白[(35±7)和(37±6) g/dL,P=0.038]和腫瘤壞死因子[(121±244)和(71±123) pg/mL,P=0.047]顯示出差異。此外，大腸桿菌的菌落形成單位數量顯著減少[(435±287)和(168±210),P=0.002]。在安慰劑組中，LPS的水平[(1.7±2.8)和(2.0±2.7) EU/mL]顯著增加。在組間比較中，各組間觀察到腫瘤壞死因子(P=0.042)和LPS(P=0.028)的顯著差異。

通過白介素-22、粒細胞集落刺激因子或法尼酯X受體激動劑、抑制細胞凋亡、早期肝移植和通過抗生素或糞便移植方法調節腸道微生物群來促進肝再生，是目前臨床研究的新課題。抑制氧化應激、調節腸道菌群以及刺激祖細胞增殖和促炎途徑，將是今后的研究方向[12]。

四、 腸道微生態與非酒精性肝病

非酒精性脂肪肝(NASH)的發生發展包括基因差異、脂肪堆積、胰島素抵抗和腸道微生物群的變化等多方面因素，其中腸道微生物群被認為起著重要作用，會影響肝臟疾病的肝硬化前期和肝硬化，這可能會為診斷、治療和研究帶來新的策略[13]。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)出現的進展性纖維化是肝臟死亡的最重要預測因素。在一項前瞻性研究中[14]，研究者用從糞便樣本中提取的DNA全基因組測序來描述腸道微生物組的組成。這項研究包括86例經過肝活檢證實的NAFLD患者，其中72例有輕/中度(0～2纖維化)NAFLD，14例晚期纖維化(3級或4級纖維化)，發現了一組40個特征(P<0.006)，其中包括37種細菌，被用來構建一個隨機的森林分類模型，以區分出輕/中度的NAFLD與晚期纖維化。該模型具有較強的診斷準確性(AUC 0.936)，用于檢測晚期纖維化，為通過糞便微生物宏基因組學特征來檢測肝纖維化進展提供了初步的證據。

五、 腸道微生態與肝細胞癌

近年研究表明，腸道菌群作為門靜脈內毒素的主要來源可能在肝硬化和肝細胞癌(HCC)的發生發展中起著至關重要的作用[15]。Grat等[16]納入15例肝癌患者和15例非肝癌但因肝硬化及晚期肝病而行肝移植的患者，對其進行了肝移植MELD評分，對其腸道微生物概況的分析是基于從移植前階段收集的糞便樣本。結果顯示有無肝細胞癌的患者在年齡(P=0.506)、性別(P=0.700)、丙型肝炎病毒(P=0.999)和乙型肝炎病毒(P=0.715)感染狀況、酒精性肝病(P=0.999)和MELD評分(P=0.337)等方面相似。值得注意的是，HCC的存在與顯著增加的大腸桿菌的排泄物數量有關(P=0.025)?；诖竽c桿菌計數的HCC存在的預測與接受者-操作曲線下的面積為0.742(95%可信區間，0.564～0.920)相關聯，最佳截點為17.728(每1克糞便的菌落形成單位的自然對數)。確定的截點的敏感性和特異性比率分別為66.7%和73.3%。由此認為，腸道微生物群與肝細胞癌的存在有關，其特點是增加糞便大腸桿菌的數量，大腸桿菌的腸道過度生長可能導致肝癌發生。

六、 腸道微生態與自身免疫性肝病

為探討自身免疫性肝炎(AIH)患者腸道滲透、細菌易位和腸道菌群的變化、并評估這些變化與疾病分期的相關性，Lin R等[17]招募了24名自身免疫性肝炎患者和8名健康志愿者，通過對十二指腸活檢標本的免疫組織化學分析，對腸內緊密連接的完整性進行了評估，16 S rDNA定量PCR腸道微生物群的變化，使用ELISA通過脂多糖水平分析細菌易位，發現腸道通透性增加、微生態紊亂、細菌易位與疾病的嚴重程度有關，提示自身免疫性肝炎與腸道和腸道微生態失調有關，受損的腸道屏障可能在AIH的發病機制中起著重要的作用。有研究發現攜帶HLA-DR3轉基因AIH小鼠的腸道菌群多樣性和豐度下降，無菌鼠對刀豆蛋白A誘發的肝損傷有拮抗作用，而腸道抗原則誘導激活自然殺傷T細胞，參與到肝損傷中，提示了微生物群和AIH之間的密切關系[18]。

回顧自身免疫性肝炎的發病機制和治療，發現了腸道微生態在先天和適應性免疫反應方面的作用，從而促進系統免疫介導性疾病的發展[19]。腸道菌群組成的改變會擾亂腸道和系統的免疫耐受。腸內的toll樣受體可以識別相關的分子模式，并形成T輔助淋巴細胞的子集，這些淋巴細胞可以與宿主產生抗原交叉反應(分子模仿)。激活的腸道衍生的淋巴細胞可以遷移到淋巴結，而由腸道衍生的微生物抗原可以轉移到腸道外的地方。炎癥因子可以在肝細胞和肝星狀細胞內形成，并且可以驅動促炎癥、免疫介導性和纖維化反應。飲食、益生菌、維生素補充劑、抗生素、減少腸道滲透性的藥物，以及阻斷信號通路的分子干預，可能會成為補充常規免疫抑制管理的輔助療法。

盡管許多研究表明益生菌對慢性肝病有益，但還是有爭議。有國外學者研究探討益生菌療法在緩解慢性肝病的腸道細菌過度生長(SIBO)和通透性方面的功效[20]：53例慢性肝病患者被隨機分為益生菌治療或安慰劑，使用了6種細菌：雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌，4周后研究糞便細菌、SIBO、腸道通透性和臨床癥狀的變化。結果提示：益生菌治療組(P<0.001)的糞便中增加了6種益生菌中的3種，而在安慰劑組中，糞便微生物群沒有發生變化。在許多益生菌治療組中SIBO消失了，但在安慰劑組一個都沒有消失(24%比0%，P<0.05)；一般的胃腸道癥狀在益生菌組中也有改善，腸道通透率的提高在益生菌組比安慰劑組稍微多一些(50%比31.3%，P=0.248)；糞便中乳酸菌的數量與腸道通透率負相關(P為趨勢<0.05)；兩組中肝臟生化學并沒有顯著改善。由此認為，慢性肝病的短期益生菌管理對緩解SIBO和臨床癥狀有效，但對改善腸通透性和肝功能無效。

隨著人們對腸-肝軸認識的深入以及系統生物學的進步，腸道微生態在慢性肝病的發生發展中的作用已越來越受到重視，但腸道微生態紛繁復雜，慢性肝病多種多樣，要進一步闡明其作用機制和管理策略，尚需深入的基礎研究和大樣本的隨機對照臨床研究。