基于腸道微生物探討哮喘發病的免疫機制及黃芪的干預作用*

劉 旭 張姝翌

哮喘是一種普遍的慢性呼吸道疾病，一般表現為氣道慢性炎癥，其中就包括部分免疫細胞，例如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、氣道上皮細胞等。這些免疫細胞的異?？梢砸鸷粑姥装Y性疾病。近些年來，隨著大氣污染及霧霾的廣泛波及和遺傳等因素的影響，哮喘的發病率及復發率呈直線上升的趨勢。流行病學調查顯示，十年間哮喘發病率平均上升了52.8%，這對患者、家庭和社會經濟都造成了極其嚴重的影響[1,2]。迄今為止，吸入糖皮質激素(ICS)依舊是支氣管哮喘最有效的治療方法。然而多數臨床報道顯示，過量吸入糖皮質激素可能會造成藥物依賴或耐藥性以及其他不良反應，特別是對在兒童期發生哮喘的患者，因為吸入糖皮質激素的治療方法會影響兒童的免疫系統，使其產生激素依賴性。因此，我們需要一種替代激素治療的方法。最近，有研究提出了腸道菌群參與過敏性炎性疾病發生和發展的假說，并且可以通過檢測腸道菌落的結構來預測患哮喘的風險。Brett Finlay[3]等分別采集了319個嬰兒在3個月和1歲時的尿液及糞便樣本，以及他們在1、3、5歲時的健康情況，通過使用高通量基因測序來檢測樣本中的腸道微生物水平，檢測發現，缺乏四種腸道菌群(Lachnospira， Veillonella，Faecalibacterium，Rothia)的嬰兒都在1歲時表現出了早期哮喘的癥狀。由此可見研究腸道微生物與哮喘的發生發展機制有著重要的意義，調控腸道微生物的組成還有可能成為預防或治療哮喘的有效方法，從而提出了“肺-腸-菌”軸的概念。

1 哮喘發病中的“肺-腸-菌”軸

目前，哮喘的發病機制尚不明確，但關于T淋巴細胞分化轉錄的研究已成為探索哮喘免疫發病機制的主要方向，其中Th1/Th2失衡學說一直以來被奉為哮喘發病的主導核心理論。最新研究顯示，Th17細胞、調節性T淋巴細胞及樹突狀細胞等也共同參與著哮喘免疫學的發病機制，即Th17/Treg的免疫失衡機制[4]。

研究認為，腸道微生物在維持人體腸道免疫平衡與能量平衡中同樣起到至關重要的影響。且大量研究證實，腸道微生物不僅單單維持腸道免疫調節，還能影響到外周器官，例如肺[5]。研究發現，腸道微生物結構的改變和免疫平衡的失調與多種肺部疾病發病相關，例如抗生素的使用會造成腸道菌群的失調，最終會增加肺炎及Th2細胞誘導的哮喘[6]。腸道微生物的失調與多種肺部疾病相關，其中就包括過敏反應、哮喘和囊性纖維化。肺與腸的雙向調節(稱為肺-腸軸)最好的例子就是在肺部疾病中可以觀察到腸道內菌群紊亂，而如今研究表明，服用益生菌可以對肺部疾病的愈合起到正向調節的作用[7]。以下分別從上述兩種機制探討腸道菌群在哮喘發病中的重要作用。

1.1 腸道微生物干預Th1/Th2失衡機制Th1/Th2分泌的細胞因子相互影響和制約所形成的相對動態平衡，共同維持著機體的免疫功能。哮喘發病的一個關鍵環節就是Th1細胞因子減少，Th2細胞因子增加。其中Th1細胞主要分泌IFN-γ、IFN-β、IL-2、IL-12等，主要功能是介導細胞免疫，并且以IFN-γ為代表性細胞因子，從而體現其生物學的效應；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等，主要功能是介導體液免疫，并且以IL-4為代表性細胞因子，從而體現其生物學效應。所以我們一般通過檢測IFN-γ和IL-4的含量多少來反映Th1/Th2的細胞群的功能狀況和分布范圍[8]。IFN-γ作用于IFN-γ受體，激活信號傳導因子STAT-1，進而激活Th1細胞的正向調控轉錄因子T-bet的表達，而T-bet又可以正反饋誘導IFN-γ基因的轉錄。T-bet轉錄因子還可以結合IL-4基因3’端沉默區復合反應元件，抑制IL-4基因表達。所以轉錄因子之間的相互制約作用可以穩定IFN-γ和IL-4的遺傳表達，最終維持T細胞向Th1細胞的表型分化。原始CD4+T細胞分化的Th2細胞在IL-4/STAT6信號通路上進行轉錄，從而誘導Th2細胞分化的主要轉錄因子GATA-3在其上進行表達。GATA-3可結合Th1和Th2細胞因子基因的靶向調節序列，減少Th1表達和增加Th2表達。這就從基因層面詮釋了Th1/Th2的平衡機制[9]。這可以說明轉錄因子GATA-3在Th1/Th2的平衡中起主要調節的作用，這就會引起Th2細胞明顯增多，從而造成Th1/Th2 失衡，進而導致了哮喘的發生發展及病理性的改變。這項研究也進一步驗證并完善了引起哮喘的免疫學機制是以Th2 細胞的相對增多所導致的Th1/Th2平衡失調。過敏性炎性疾病(如哮喘)的發生與年齡有關，而腸道微生物也會隨著宿主年齡的增長而變化，這二者的相關性特征并非巧合[10]。有研究表明，由腸道菌群失調而導致的高水平血清炎性因子會增加哮喘患兒的發病率[11]。腸道菌群可以通過模式識別受體的作用以及其代謝產物的間接作用從而作用于腸道上皮細胞、樹突細胞、T淋巴細胞等，使其共同參與免疫應答，并且誘導Th細胞向Th1方向分化，同時抑制Th2型炎性反應，來維持Th1/Th2的免疫平衡，從而緩解哮喘的進一步發展[12]。劉崇海[13]在其動物實驗研究中用煙曲霉菌來誘導小鼠產生變應性反應，由此觀察小鼠因抗生素所致的腸道菌群失調，以此觀察變應性氣道反應和腸道菌群失調之間的關系。實驗研究證明，抗生素所導致的腸道菌群失調的小鼠通過煙曲霉菌變應原氣道激活后，可以導致體內Th2 細胞因子增加，由此加重氣道變應性反應，這項研究證明了抗生素導致的腸道微生物菌群失衡是哮喘等變應性疾病發生的相關誘因。在周圍環境因素的刺激下，比如脆弱擬桿菌產生的多糖(PSA)，其Th0細胞逐漸向抗感染的Th1型免疫反應方向進行偏移，使體內Th1細胞增多，這就讓Th1/Th2達到平衡，以防誘導變應性反應的發生與發展[14]。MOUSSU[15]在實驗中給患哮喘小鼠口中含服雙歧桿菌益生菌制劑，結果發現可以減輕小鼠的氣道高反應，進一步研究發現，雙歧桿菌益生菌制劑增強了小鼠的免疫耐受功能，下調了Th2，以此緩解變應性反應，從而提示菌群定植可以影響哮喘的發生，以及可以有效調節Th1/Th2的平衡，增強免疫耐受的作用。如果腸道微生物菌群平衡被破壞，造成菌群多樣性或數量減少，那么機體會主導Th2表達，所以就會導致變態反應性疾病的發生。普通小鼠體內的IL-17以及IFN-γ等細胞因子與無菌小鼠相比，表達水平相對較高，而與之相對應的CD4+、CD25+、Foxp3+調節T細胞數量卻明顯減少。這表明，腸道微生物對機體內促炎癥和抗炎癥兩種免疫反應之間的平衡有一定的影響[16]。

1.2 腸道微生物干預Th17/Treg免疫失衡早些研究已證實，在支氣管哮喘發病中Th1/Th2細胞失衡起關鍵作用，但是隨著醫學的進步，一些研究表明，支氣管哮喘的發病機制僅僅只用Th1/Th2細胞失衡學說來解釋已經不夠全面[17,18]。經典的Th1/Th2失衡學說不能一并概括哮喘的發病機制，且研究證實Th17/Treg的免疫失衡在支氣管哮喘的發作中起到了關鍵的作用。Th17細胞可以通過分泌IL-17作用于嗜酸性粒細胞，從而促使嗜酸性粒細胞釋放化學介質，增強炎癥反應[19]。Treg細胞具有免疫抑制活性，可以分泌IL-10和TGF-β抑制T細胞增值及Th1和Th2的細胞因子反應。TGF-β又可以通過Smad7通路調節Foxp3轉錄因子增加Treg的表達。然而當存在感染時，致敏的樹突狀細胞等分泌IL-6與TGF-β協同作用于CD4+T細胞，使之朝向Th17方向分化，主導慢性炎癥應答，其分泌的IL-17起到很強的促炎癥反應，從而活化中性粒細胞并導致多種炎癥因子的分泌，引起局部炎癥，并且它還能作用于特定的細胞，使其放大或調節適應性免疫[20,21]。由于Treg細胞有免疫抑制活性，參與機體的免疫調節機制，所以Treg細胞可以通過負反饋調節T細胞活化所引起的免疫反應，研究發現在哮喘患者外周血中，Th17和IL-17顯著增高，而Treg、IL-10則減少[22]。所以Th17/Treg及其分泌的最具有代表性細胞因子IL-17/IL-10之間的拮抗作用彌補了研究的缺憾。Th17/Treg的失衡以及腸道菌群的失調共同調控人體內炎癥性疾病的發展和轉歸。腸道微生物參與這一機制主要是通過Th17細胞提供的通路來實現的。Th17細胞產生的細胞因子IL-17來源并非一處，例如回腸中的分節絲狀菌(SFB)就可以誘導IL-17的產生[23]。而在哮喘發病過程中IL-17又是重要的細胞因子，它貫穿參與到哮喘發病中的氣道炎癥、氣道阻塞、氣道高反應性、氣道重塑等方面[24]。Treg推動了腸道菌群與哮喘關系之間的研究進展, 在研究中發現腸道菌群定植是Th1和Treg 細胞隨年齡逐漸成熟的主要驅動因素，而Treg細胞對抑制Th2細胞增多所產生的相關過敏反應有重要的作用，所以可以增加Treg細胞來發揮抗炎的作用[25]。尚有研究認為，肺-腸軸的內在聯系主要是通過可遷移至其他黏膜組織(如支氣管黏膜上皮)的Treg來完成的。然而這些關于“肺-腸-菌”軸的研究還停留在細菌分類標記水平，對微生物功能以及微生物與宿主的交互作用的研究有待完善。

2 益生菌在哮喘治療中的應用

研究顯示益生菌可以在腸道內定植,通過肺-腸軸影響肺部的微生物菌群,從而影響肺部的免疫功能,對哮喘有一定的治療作用,可以成為治療哮喘的潛在新藥[26]。由此可見益生菌在哮喘的發展轉歸中有重要作用。目前已經有一些隨機對照試驗(RCT)研究發現益生菌制劑在改善哮喘臨床癥狀以及減少藥物服用方面有積極效果。鼠李糖乳桿菌是人體內正常菌群之一，具有腸道黏率高，定植力氣強等作用，Vamshi Saliganti[27]利用瑞士白化小鼠研究鼠李糖乳桿菌MTCC5897對OVA所誘發小鼠過敏癥的實驗中發現，MTCC5897能夠促進IL-4水平的降低和TGF-β水平的增加。然而益生菌在預防哮喘發病中的優勢并非普遍，雖然益生菌能夠預防人體患過敏性疾病，并且在治療過敏性疾病中起到重要的作用，但是也存在著諸多問題。雖然大多數研究人員證實益生菌在治療過敏性及炎癥性疾病中發揮重大的作用，但也有一部分實驗結果顯示無效，例如有研究表明益生菌在改善成年人哮喘免疫失衡方面未見明顯優勢[28]。因此，益生菌治療哮喘的方案仍需進一步明確研究。

由此可見，單純的希望通過利用益生菌制劑調整腸道菌群來治愈哮喘并不現實，目前需要尋求一種既可以作用于哮喘免疫機制又能夠激活微生物發揮免疫干預的藥物來控制哮喘的發生和發展。近年來科學研究從中醫“肺與大腸相表里”“培土生金”等理論中發現，在西醫學中可以從呼吸道黏膜免疫與腸消化道黏膜的研究方向逐漸深入；組織學研究發現，呼吸系統的上皮及實質和消化系統腸道粘膜大多來自于原始消化管的內胚層，它們二者在動物胚胎時期屬于同一個器官，由于在胚胎的逐漸發育過程中，才逐步分化成為消化系統與呼吸系統[29]。現代醫學研究也證實了消化道和呼吸道粘膜是共同黏膜免疫系統的一部分。

3 黃芪干預哮喘的探究

有研究顯示[30]黃芪在治療哮喘上具有減輕氣道炎癥，調控氣道重塑以及調節免疫功能上具有明確的療效，且在“玉屏風散”“平喘固本湯”“六君子湯加味”等組方中都體現了中藥黃芪的應用；且黃芪可以抑制Th2細胞增加，有效的調節Th1/Th2平衡，從而避免體內產生炎癥性反應，研究發現黃芪可調節神經內分泌免疫[31]。因此，中藥黃芪對肺-腸-菌軸的干預作用應當引起重視，以下從中藥黃芪的主要成分進行探究。

3.1 黃芪甲苷(ASI)干預免疫調節中藥黃芪的主要成分之一是黃芪甲苷(C41H68O14)。有實驗研究顯示[32]黃芪能夠促使Th1中IFN-γ、IFN-β兩因子的水平增高，從而提高對身體的保護能力，而Th1和Th2是能夠調節細胞免疫和體液免疫的因子之一。由此可見，黃芪甲苷對由Th1/Th2失衡所引起的哮喘在平衡調節中起到重要作用。蔡萃等[33]利用ASI腹腔注射干預哮喘小鼠模型，觀察了ASI對嗜酸性粒細胞(EOS)浸潤的并對其中機理進行了分析，認為ASI能夠減少EOS的浸潤，降低GM-CSF、IL-5等細胞因子濃度，對eotaxin/CCR3介導哮喘通路有抑制作用，下調CCR3 mRNA的表達。IFN-γ可以使眾多轉錄因子被激活，從而表達炎癥介質，而ASI 能夠通過抑制 STAT1/IκB/NF- κB信號通路的激活，降低炎癥狀態下小膠質細胞 IL- 1β、TNF- α和iNOS的基因表達，從而減少NO和TNF-α的生成和抑制IFN-γ誘導的小膠質細胞被激活[34]。然而，最新研究表明[35]ASI在體內的代謝需要經腸道微生物代謝，ASI經胃腸道吸收較差，口服無首過效應，其代謝途徑主要是通過腸道微生物轉化后發生糖基水解作用，其水解產物進入血液循環達到血藥濃度后發揮藥效作用。在中藥方劑固本防哮飲中，研究發現方藥中的黃芪成分ASI可以有效的緩解哮喘發病中氣道阻塞感、呼氣障礙，減輕呼吸道炎癥，促進炎癥細胞中抑炎因子IFN-γ的高分泌水平以減輕氣道炎癥的反應[36]。

3.2 黃芪多糖(APS)干預免疫調節黃芪的另一有效成分黃芪多糖對腸道微生物的構成則有重要調節作用。凌昊[37]研究表明APS能夠抑制IL-4的產生及EOS的活化，減輕EOS浸潤，促進Th0細胞向 Th1細胞分化，從而達到Th1/Th2平衡，抑制炎癥因子的釋放等；且可以降低氣道高反應性。梁金花等[38]通過動物實驗發現黃芪多糖可以促進大鼠體內雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長，降低腸球菌和腸桿菌在體內的含量。然而李樹鵬等[39]用APS對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌3株致病菌進行體外干預，發現均有抑制作用，但APS對乳酸菌和芽孢桿菌也存在體外抑制作用，因而推斷APS并非是簡單的通過上調有益菌抑制致病菌而實現腸道菌群調節，其機制尚待研究。

4 討論

綜上所述，可提出研究假設：“肺-腸-菌”軸在哮喘發病機制中有重要作用。而中藥黃芪及其有效成分黃芪甲苷、黃芪多糖，不僅可以直接參與機體免疫反應，而且可以間接通過調控腸內微生物干預哮喘發生的免疫機制。因此，探討中藥黃芪及其有效成分在哮喘治療中的具體機理有利于該機制的進一步明確。目的在于證明黃芪通過調節腸道菌群恢復肺腸菌軸的功能最后起到治療哮喘的作用。