冬季鳳眼蓮對鹽脅迫的鹽害表現及生理響應

周丁陽，徐娜娜，朱旭輝，徐嘉俊，盛建龍，王子豪

(浙江海洋大學水產學院，浙江舟山 316022)

鳳眼蓮Eichhornia crassipes (Mart.) Solms，是一種大型漂浮水生植物，喜高溫濕潤環境，是世界上生長繁殖速率極快，產量極高的水生植物之一。雖然被列為世界十大惡性雜草之一[1]，但因其對水體污染物較強的吸收積累與分解轉化能力，被成功應用于處理各類廢水并在世界范圍內得到了廣泛的認可[2-3]。在25～35℃溫度中，8 個月內能從10 株增長到80 萬株，繁殖能力極強[4]。鳳眼蓮自1911年引入浙江省杭嘉湖平原后，現已廣泛分布于我國19 個省(自治區、直轄市)，在長三角、珠三角地區河流湖泊等淡水水域泛濫成災[5-6]，環境適應力驚人，但是對于鳳眼蓮在咸水或半咸水中自然生長的案例目前還未有報道。有研究發現，鳳眼蓮在鹽度為10 的灘涂養殖廢水中能較好的生長并吸收大量營養鹽[7]，說明其具有一定的耐鹽力。然而，目前對鳳眼蓮的研究多集中在探討其對水體氮、磷、重金屬、有機污染物等的去除效果以及在污染水體中的響應機制[8-11]，未見有關鹽脅迫的報道。此外，鳳眼蓮為多年生水生植物，性喜溫暖，在高溫環境中生命力旺盛，但抗寒能力較弱[12]，一般可耐低溫5℃，當氣溫13℃或水溫10℃以上才開始生長[13]。它在低溫脅迫下葉片細胞內的電解質大量外滲，質膜透性增加[12]，會造成生理干旱和有毒物質積累[14]，因而有學者關注不同溫度下鳳眼蓮的污水凈化能力[15]。所以本試驗在冬季研究鳳眼蓮對鹽脅迫的鹽害表現及生理響應將有更實際的應用意義。

試驗在冬季開展，模擬不同鹽脅迫環境，以鳳眼蓮葉的鹽害表現，細胞膜膜脂過氧化反應、抗氧化酶活性以及滲透調節的生理響應來探討鳳眼蓮的適應性情況，以期獲得植物在舟山冬季的溫度條件下最高耐受的鹽度范圍，為鳳眼蓮修復河口、內陸咸水湖等污染水體的工程應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鳳眼蓮在舟山市溫度條件(季風明顯，年平均氣溫16.7℃，冬季平均7.0℃)自然生長，植物于2017年11月19 日采回，通過除雜清洗挑選，在室外PVC 大棚(透光率為85%～93%)內保持自然光照(午間光強為904.5～12 400 lx)，于PP 材質48 L 方形透明儲物箱(長55 cm×寬39 cm×高31 cm) 中使用標準配比的Hoagland 完全營養液(北京溪青青農業科技有限公司)中馴化2 周，馴化時氣溫為8.8～18.3℃，濕度為46%～96%，植株均長勢良好。

1.2 試驗設計

試驗于2017年12月3 日在標準配比的Hoagland 完全營養液中添加海鹽(廣州益爾生物工程有限公司)，設置5、10、14、18、21 的鹽度梯度，以不添加海鹽為對照(實測培養液鹽度為1‰)，每個鹽度梯度設3個重復，共18 個培養單元。每個培養單元挑選株型相近、健壯、鮮重185.12±9.28 g 的鳳眼蓮用于鹽脅迫試驗，培養11 d，試驗時氣溫為4～16.5℃，濕度為45%～94%。每天使用便攜式pH 計電導率儀溶氧儀(AZ8603)測量培養水的水溫、pH、DO 和鹽度，并補充蒸發水分保證鹽度條件，觀察測量記錄鳳眼蓮葉的鹽害表現。11 d 后，各個培養單元稱取0.3 g 左右的葉片用于生理生化指標測定。

1.3 鹽害表現觀察

根據鳳眼蓮葉的鹽害表現，將鹽害分級[16]劃分為5 級，包括0 級，生長正常，葉片無傷斑無卷曲，且葉柄無鹽害癥狀(圖1A)；1 級，輕度鹽害，葉片傷斑或卷曲枯黃面積＜25%(圖1B)；2 級，中度鹽害，葉片傷斑或卷曲枯黃面積在25%～50%之間(圖1C)，或葉柄有膨壓降低，稍變軟保持直立；3 級，重度鹽害，葉片傷斑或卷曲枯黃面積在50%～75%之間(圖1D)；4 級，極重度鹽害，葉片傷斑或卷曲枯黃面積＞75%(圖1E)，或葉柄嚴重膨壓降低軟化并且倒伏(圖1F)。最后，根據如下公式[16]計算鹽害指數(salt injury index，SI)。

圖1 5 個鹽害等級鳳眼蓮葉的形態特征Fig.1 Leaf morphological characteristics of E.crassipes on five salt injury levels respectively

1.4 相對生長速率計算

用電子天平(精度0.01 g)在試驗開始及試驗結束分別測得各組鳳眼蓮植株的鮮重，根據如下公式[17]計算相對生長速率(relative growth rate，RGR)。

1.5 生理生化指標測定

使用南京建成生物研究所的試劑盒，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法、脯氨酸(Pro)采用酸性茚三酮比色法、超氧化物歧化酶(SOD)采用羥胺法、過氧化物酶(POD)采用愈創木酚法，測定鳳眼蓮葉片中氧化逆境產物和滲透調節物質的含量以及抗氧化酶活性。

1.6 數據處理

應用SPSS19.0 對數據進行相關性分析、單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD 多重比較，方差不齊時用非參數的kruskal-wallis H 檢驗。

2 結果

2.1 不同鹽脅迫下鳳眼蓮的生長變化

2.1.1 鹽害指數(SI)

對照組在5～7 d 出現鹽害表現(表1)，之后平緩，結束時的SI 為21.5%±2.2%，顯著低于各鹽處理組(P＜0.05)，有輕度鹽害特征；5 的SI 在第4～6 天上升較快，結束時各個鹽害級別特征的葉均有出現，SI 為45.0%±4.9%，顯著低于高鹽度組(P＜0.05)；10 的SI 逐步升高，在試驗最后一天有平緩的趨勢，達到72.4%±4.7%，有半數以上葉達到3 或4 級鹽害特征，實驗結束時對照組、5 和10 的SI 呈顯著線性遞增(R2=0.974，P＜0.01)；14、18 和21 的SI 在試驗1 d 時迅速上升到52.0%±6.3%、79.2%±2.1%和80.7%±6.6%，培養11 d 后鹽害表現明顯，SI 均達到90%以上，且三者第10 d 開始無顯著性差異。

表1 不同鹽脅迫下鹽害指數隨時間的變化Tab.1 Changes of SI with time under different salt stress

2.1.2 鮮重及株數

試驗開始時各組鮮重及株數均無顯著性差異(表2)。培養11 d 后，RGR 除對照組為0.52%±0.27%，鹽脅迫處理組均為負值，10 及更高鹽度與對照均存在差異性(P＜0.05)，其中10 的RGR 最低，為-0.90%±0.20%。對照組、5、10 的RGR 呈現顯著的線性遞減(R2=0.779，P=0.002)。

表2 不同鹽脅迫下鮮重及株數變化Tab.2 Changes of fresh weight and the number of plants under different salt stress

2.2 不同鹽脅迫下鳳眼蓮的生理響應

2.2.1 SOD 與POD 活性以及MDA 含量

鳳眼蓮葉片的SOD 活性表現出隨鹽度增加而增加的趨勢(圖3A)，并且均顯著高于對照組(P＜0.05)。對照組SOD 為1 156.46±21.20 U·g-1，在14 下SOD 活性最高，為1 245.76±0.97 U·g-1。

隨著鹽度的升高，鳳眼蓮葉片的POD 活性表現出先升高再降低的趨勢(圖3B)，在鹽度14 下POD 活性達到最高，為340.33±11.24 U·g-1，是對照組的1.27 倍；而21 的POD 活性最低，下降至244.33±21.08 U·g-1，為對照組的0.91 倍。非參數kruskal-wallis H 檢驗結果顯示，鹽處理組鳳眼蓮葉片的POD 活性與對照組不存在顯著性差異。

在不同鹽脅迫下，鳳眼蓮葉片的MDA 含量積累不同(圖3C)，其中10 的MDA 含量最高，達到41.4±3.87 nmol·g-1，為對照組的1.44 倍，顯著高于對照組以及5、14 和18(P＜0.05)。對照組、5 和10 下葉片MDA含量隨鹽度增高呈顯著線性增加(R2=0.615，P=0.012)。

2.2.2 Pro 含量

鹽度從對照組逐級到10，鹽脅迫逐漸加大，鳳眼蓮葉片中的Pro 含量也隨之逐級升高(圖3D)，并且3個鹽度之間存在顯著性差異(P＜0.05)，葉片Pro 含量沿鹽度增加而線性遞增(R2=0.884，P＜0.01)。Pro 含量在10 達到最高的57.07±9.20 μg·g-1，為對照組的2.63 倍，但當鹽度繼續升高反而有下降趨勢，21 的含量為46.76±6.22 μg·g-1。

圖3 不同鹽脅迫下SOD 和POD 的活性以及MDA 和Pro 的含量Fig.3 Activities of SOD，POD and content of MDA，Pro under different salt stress

3 討論

3.1 鹽脅迫對鳳眼蓮葉的形態損害

試驗期間多次受到冷空氣影響[18]，對照組鳳眼蓮因低溫脅迫，部分葉片表現為外緣枯黃的特征[19]。鹽脅迫引起植物的水分虧缺以及離子毒害，處理組均出現不同程度的鹽害特征。5 的植株在脅迫開始后部分葉片外緣略微卷曲，出現水漬狀斑點，受損部分之后逐漸枯黃，頂生幼葉始終保持健康狀態。其SI 在4～7 d也快速升高，說明同期也受到了低溫的影響。最后數據趨于穩定表明鳳眼蓮通過自我調節已經適應了5 的鹽度環境。10 的鳳眼蓮在脅迫開始后大量葉片脫水卷曲，之后外緣逐漸枯黃，試驗8 d 后植株無健康葉片，而葉柄的鹽害表現不明顯。葉片的非正常衰老說明鳳眼蓮在10 的鹽脅迫下表現出犧牲局部來維系生命的被動適應策略[20]。葉片的脫水使得植株鮮重大量減少，只有當其通過自我調整，水勢下降到與環境相同或更低時，才能從外界環境吸收水分以維持生命活動[21]，其SI 在最后2 天趨向平緩可能是這個原因。

而在14、18 和21 的嚴重脅迫環境中，脅迫開始后鳳眼蓮葉柄與高鹽水體接觸，巨大的水勢可能造成了其嚴重的傷害，引起膨壓下降無法支撐葉片重量而倒伏[22]，SI 快速升高，在后續的觀察中發現，這種葉柄的損傷是不可逆的。葉緣出現大量傷斑，表現為失綠，泛白的特征，之后枯黃且傷害面積逐漸增大。相比之下，前期10 葉片失水卷曲得更厲害，可能是由于鳳眼蓮需要葉片通過通氣組織向下傳輸氧氣，供根系呼吸和根區的脫毒作用[23]，而根系又處在水分脅迫中無法向上供水，由于蒸騰作用失水卷曲。在14 及以上的脅迫中葉柄的損傷阻斷了氣體通道，蒸騰作用相對較弱，但氣體代謝不暢會致使植株衰退[23]，葉片與根系失去了根冠通訊[24]，后期會更快地衰老死亡，這與之后的觀察相符。SI 在14 下的不斷升高表明了冬季鳳眼蓮無法在該鹽度的水環境中生存。

3.2 鹽脅迫對鳳眼蓮生理的影響

植物在逆境下遭受傷害會發生膜脂過氧化作用，MDA 是膜脂過氧化的最終產物[25-26]。隨著鹽度的升高，鳳眼蓮受到的脅迫壓力增大，其逆境氧化產物積累增多，但是到14 的水環境中MDA 含量卻有一個顯著的降低，結合鳳眼蓮的形態變化，其14、18、21 下的植株在試驗1 d 后就出現大量葉柄膨壓降低，軟化倒伏的現象，加速葉片的衰老死亡，導致MDA 含量反而降低，有研究也發現在脅迫超過植物耐受極限時MDA含量下降的結果[27]。表明到鹽度14 時，鳳眼蓮的葉柄就無法耐受鹽脅迫而引起大量死亡。

植物在逆境條件下，體內抗氧化防御系統的啟動以清除過多的ROS，減緩植物所受傷害[20，28]。鳳眼蓮在5 時即受到了脅迫壓力，SOD 活性顯著增強以加快清除體內產生的ROS，維持細胞的正常生命活動[25，29]。說明在冬季的環境下，鳳眼蓮葉片的SOD 活性對水體鹽度比較敏感。而到10‰以后，SOD 活性保持在一個較高水平不再升高，這可能是因為SOD 已經達到了其最高的酶活性。POD 也是植物抵抗外界脅迫重要保護酶之一[30]。鳳眼蓮葉片的POD 活性在6 個鹽度條件下不存在顯著差異，這可能是由于低溫脅迫抑制了酶活性[12]，POD 對鹽度的升高不再敏感。

鳳眼蓮在高鹽環境下處于生理干旱狀態會大量合成滲透調節物質來保持自身較低的水勢[21，31]，在鹽濃度未達到損傷植物生長的前提下其葉組織Pro 的響應能反映植株受鹽脅迫的相對程度[32]。當水環境從對照組到10 的變化中，鳳眼蓮葉片中的Pro 含量也隨之逐級顯著升高，并且存在較好的線性關系，這說明植株受到鹽脅迫的相對程度在逐漸提高。有研究認為Pro 不僅能提高植物的滲透壓，還能提升植物抗氧化劑的活性[33]。而當鹽度繼續升高時，Pro 含量反而有些降低，這表明到10 條件時鳳眼蓮可能已經達到了Pro含量積累的最高值，并且當鹽度繼續升高，脅迫強度超過了植株的耐受范圍，細胞無法維持Pro 的合成工作，最終也會導致鳳眼蓮的死亡[34]。Pro 含量的結果也表明鳳眼蓮無法適應鹽度14 的水環境。

通過Pearson 相關性分析(表3)，植物體內SOD 酶活性、Pro 含量變化與水體鹽度三者之間均呈極顯著正相關變化(P＜0.01)，這表明冬季鳳眼蓮對鹽脅迫的生理相應中，SOD 酶活性的提高以及Pro 的合成積累對植物的抗逆性起著重要作用。

表3 鹽度和植物生理生化指標的Pearson 相關性分析Tab.3 Pearson conclusion of the physiological indexes and salinity

綜上所述，在舟山冬季溫度條件下，鳳眼蓮在5 和10 的鹽脅迫中以葉片的形態損傷為主，當鹽度達到14 及更高其葉柄會失水倒伏。葉片中MDA 含量增多，植物表現出SOD 活性顯著提高，積累Pro 等的應對策略，其中Pro 含量對SOD 活性呈正相關性，但當鹽脅迫超過植物耐受極限(本試驗中為14)時MDA 含量下降。而POD 活性受到低溫抑制，對鹽脅迫不敏感。鳳眼蓮自我調節能力有限，冬季可耐受的最高鹽度可能在10～14 之間。