魷魚及蝦蟹加工下腳料發酵工藝研究

梁月欽，夏 磊，李 怡，聞正順

(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022；2.舟山市農產品質量安全管理中心，浙江舟山 316021)

目前市面銷售的菌種種類和數量與日俱增，許多研究都直接選取市售的微生物制劑進行試驗。由于經過市場驗證，市售菌一般都具有純度高、活性好、成本低、無毒副作用、不污染生態環境等特點[1]，因而在各領域都具有廣泛應用。生活垃圾資源化、土壤改良、病蟲防害、污水處理等都有賴于微生物的作用[2-3]。

我國目前水產行業急速發展，但水產加工業的滯后導致了大量水產品廢棄物的出現。盡管國際上試圖通過各種廢物處理系統減少廢物，但每年產生的廢物量一直在增加[4]。這些水產下腳料是重要的蛋白質和礦物質來源[5]，通過不同的方法例如微生物發酵水解，可以有效利用這些副產物。實際上，蝦蟹的廢棄物依然具有不可估量的商業價值[6]。例如，將小蝦進行一定程度的深度加工可以制得價值數倍的人造對蝦[7]。例如用魷魚內臟制備魷魚醬油，提取黑色素，生產鈣制品等[8-10]，都是對廢棄物的合理利用，是變廢為寶的有效途徑。本文以魷魚內臟、蝦蟹下腳料為發酵基質，利用一種包含了光合菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌類的商業混合菌進行發酵技術和相應工藝的優化，為商業混合菌種合理利用水產品下腳料提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業菌：徐州益邦環保科技有限公司；

魷魚內臟、對蝦下腳料、梭子蟹下腳料：舟山國際水產城；

碳酸鈉、氫氧化鈉、無水硫酸銅、酒石酸鉀鈉等均為分析純，福林酚試劑（BR）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1600 型紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋：金壇市億能儀器實驗廠；THZ-82B 氣浴恒溫震蕩器：金壇區白塔金昌實驗儀器廠；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DGG-9140A 型電熱鼓風恒溫干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；YC-260 L 4℃冰箱：上海啟閔生物科技有限公司；FA1004N 分析天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；TG20-WS 離心機：長沙湘銳離心機有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵工藝

下腳料儲存于-20℃冰箱中，通過流水解凍，稱取2.0 g 下腳料，然后加入一定比例的無菌水，最后將商業菌液在無菌環境下接種到下腳料底物中進行單因素以及正交試驗。發酵結束后離心取發酵上清液，利用福林酚法測定發酵液中可溶性蛋白的含量[11]，并計算出結果。

1.3.2 單因素試驗設計

用預實驗測定單因素水平范圍。試驗選取發酵溫度、菌種接種量、料水比以及培養時間這4 個因素作為試驗的單因素，根據發酵液中可溶性蛋白轉化率來判斷各因素對發酵效果的影響[11]。

1.3.3 正交試驗設計通過前期單因素實驗，選取上述4 種發酵因素來設計4 因素3 水平正交試驗。正交試驗設計如表1。

表1 正交試驗設計Tab.1 Orthogonal experimental design

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 可溶性蛋白含量測定

用Folin-酚法進行發酵結果的測定[12]。

1.4.2 可溶性蛋白轉化率測定

可溶性蛋白轉化率計算公式為：

式中M：蛋白轉化率；Y：發酵前可溶性蛋白含量；X：發酵后可溶性蛋白含量；N：發酵原料總蛋白含量。

2 結果與討論

2.1 商業菌發酵魷魚內臟試驗結果

2.1.1 魷魚內臟單因素試驗結果

2.1.1.1 料液比單因素試驗結果

固定菌液接種量為25%，發酵溫度為30℃，發酵時間為1 d，將料水比設為1:1、1:3、1:5、1:7、1:9。采用福林酚法測定發酵后蛋白轉化率。實驗結果如圖1 所示。

微生物生長過程中水分具有維持生命體溫、調節體液平衡等作用，而在發酵過程中添加適量的水，在為益生菌提供生長環境的同時也能夠對其生命活動起到增益效果。從圖1 可以看出，蛋白轉化率隨著水分添加量不斷增加，料液比1:7 時達到最高，隨后開始下降，可能是過多的水分導致底物被稀釋從而影響了微生物代謝。

2.1.1.2 菌液接種量單因素試驗結果

固定發酵溫度為30℃，料水比為1:7，發酵時間為1 d，將菌液接種量設為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，發酵結束后測得發酵液中蛋白轉化率含量，結果如圖2 所示。

從圖2 可以看出，菌液接種量在30%時發酵結果明顯優于其它比例，而繼續添加產物反而下降，可能是在一定的生長環境下過多的菌體發生了競爭生長，形成了一定的生物拮抗，從而影響了發酵水平。

2.1.1.3 溫度單因素試驗結果

固定菌液接種量為25%，料水比為1:7，發酵時間為1 d，將發酵溫度設為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃進行發酵，結果如圖3 所示。

圖1 料水比對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.1 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

圖2 菌液接種量對發酵液蛋白轉化率的影響Fig.2 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

圖3 發酵溫度對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

每種微生物最適生長溫度不盡相同，故而選擇最適的發酵溫度至關重要。從圖3 可以看出，發酵溫度在30℃時蛋白轉化率明顯高于其它溫度，溫度過低菌體生長緩慢，溫度過高又會抑制菌體代謝活動，從而影響發酵結果。

2.1.1.4 時間單因素試驗結果

固定菌液接種量為25%，料水比為1:7，發酵溫度為30℃，將發酵時間設為1 d、2 d、3 d、4 d，考察發酵時間對發酵效果的影響。結果如圖4 所示。

從圖4 可以看出，發酵時間2 d 的發酵效果明顯優于其它發酵條件。可能是發酵時間過久底物營養物質已不足以供給菌體生長，或是多肽又進一步被微生物水解形成小分子肽，難以被檢測，從而導致檢測結果降低。

2.1.2 發酵魷魚內臟工藝優化試驗結果

2.1.2.1 正交試驗設計及結果

根據表2 結果，由極差R 可得，影響蛋白轉化率因素的主次為料液比＞溫度＞接種量＞時間，即料水比是影響商業菌發酵魷魚內臟蛋白轉化率最主要因素，這是由于魷魚內臟中營養成分豐富，且大多屬于水溶性，合適的料液比可以更好地幫助菌體生長，從而提升發酵結果。魷魚內臟的最佳發酵條件為料水比1:7，溫度35℃，接種量30%，時間1 d，此條件下，蛋白轉化率可達20.33%。

圖4 培養時間對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.4 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

表2 魷魚內臟正交試驗設計與結果Tab.2 Orthogonal experimental design and results of fermented salmon guts

2.2 商業菌發酵蝦下腳料試驗結果

2.2.1 蝦下腳料單因素試驗結果

2.2.1.1 料水比單因素試驗結果

條件同2.1.1.1，實驗結果如圖5 所示。

從圖5 可以看出，蛋白轉化率在料液比為1:7 時有最大值，再添加水反而稀釋了底物營養，導致發酵水平下降。

2.2.1.2 菌液接種量單因素試驗結果

條件同2.1.1.2，結果如圖6 所示。

從圖6 可以看出，蛋白轉化率隨著菌液接種量的增加不斷提高，當接種量為30%時發酵效果最好，再多的菌液反而導致競爭生長，影響發酵效果。

2.2.1.3 溫度單因素試驗結果

條件同2.1.1.3，結果如圖7 所示。

從圖7 可以看出，發酵溫度在30℃時候有蛋白轉化率最大值，此時菌體協同效果最好，生長代謝最強，從而能夠快速分解底物中的蛋白質。

2.2.1.4 時間單因素試驗結果

條件同2.1.1.4，結果如圖8 所示。

從圖8 可以看出，發酵時間3 d 時蛋白轉化率最高，此時對蝦營養基本被消耗完畢，繼續發酵反而導致可溶多肽進一步被分解。

圖5 料水比對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.5 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

圖6 菌液接種量對發酵液蛋白轉化率的影響Fig.6 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

圖7 發酵溫度對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

圖8 培養時間對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.8 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

2.2.2 發酵蝦下腳料工藝優化試驗結果

2.2.2.1 正交試驗設計及結果

根據表3 結果，由極差R 可得，影響蛋白轉化率因素的主次為料水比＞時間＞接種量＞溫度，即料水比是影響商業菌發酵蝦下腳料蛋白轉化率最主要的因素，最佳發酵條件為料水比1:7，接種量30%，溫度30℃，時間1 d，此條件下蛋白轉化率達到13.18%。

表3 蝦正交試驗設計與結果Tab.3 Orthogonal experimental design and results of fermented shrimp

2.3 商業菌發酵蟹下腳料試驗結果

2.3.1 蟹下腳料單因素試驗結果

2.3.1.1 料水比單因素試驗結果

條件同2.1.1.1，實驗結果如圖9 所示。

從圖9 可以看出，蛋白轉化率隨料液比增加而提高，在1:7 時達到最大值，繼續添加水反而導致蛋白轉化效率降低，影響最終發酵結果。

2.3.1.2 菌液接種量單因素試驗結果

條件同2.1.1.2，結果如圖10 所示。

從圖10 可以看出，蛋白轉化率隨菌液接種量的增加而不斷提高，當菌液接種量為30%發酵效果最好，繼續添加菌液反而導致競爭生長，使最終發酵蛋白轉化率下降。

圖9 料水比對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.9 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

圖10 菌液接種量對發酵液蛋白轉化率的影響Fig.10 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

2.3.1.3 溫度單因素試驗結果

條件同2.1.1.3，結果如圖11 所示。

從圖11 可以看出，發酵溫度在30℃時候蛋白轉化率最大，是菌體最適的生長溫度，溫度太高或太低都會對菌體生長產生一定的抑制，影響菌體代謝活動，從而使最終蛋白轉化率相對較低。

2.3.1.4 時間單因素試驗結果

條件同2.1.1.4，結果圖12 所示。

從圖12 中可以看出，發酵時間2 d 時底物基本消耗殆盡，此時蛋白轉化率最高，繼續發酵反而導致水溶多肽被進一步分解成小分子肽，影響檢測結果。

圖11 發酵溫度對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.11 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

圖12 培養時間對發酵液中蛋白轉化率的影響Fig.12 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

2.3.2 發酵蟹下腳料工藝優化試驗結果

2.3.2.1 正交試驗設計及結果

根據表4 結果，由極差R 可得，影響蛋白轉化率因素的主次為接種量＞時間＞料水比＞溫度，即接種量是影響商業菌發酵蟹下腳料蛋白轉化率最主要的因素，通過添加合適量的微生物能最大限度地發酵梭子蟹，最佳發酵條件為料水比1:7，接種量30%，溫度35℃，時間1 d，此條件下蛋白轉化率可達12.76%。

表4 蟹正交試驗設計與結果Tab.4 Orthogonal experiment design and results of fermented crab

2.4 討論

商業混合菌發酵魷魚內臟的蛋白轉化率可達20.33%；發酵蝦下腳料的蛋白轉化率可達13.18%；發酵蟹下腳料的蛋白轉化率可達12.76%。由結果可見，商業混合菌發酵魷魚的效果相對蝦蟹較高，說明底物對微生物發酵影響較大。而蛋白約占蝦蟹下腳料干重的1/5[13]，相較于單一菌種的發酵，商業菌對蝦蟹下腳料的轉化結果相對較高。這主要得力于各菌種的協同作用，特別是其中的某些高效菌種發揮主要作用。已有研究表明，按照一定比率混合動物蛋白和植物蛋白共同發酵，可以將植物中限制性氨基酸的相關影響降到最低，平衡產物中氨基酸含量，從而可以加工成極具營養價值的高效飼料[14]。特別是一些高蛋白的原料，含量雖高，卻難以被吸收利用，通過微生物發酵，可以將其中的大分子物質轉化成易于吸收的小分子物質。利用微生物處理下腳料不僅賦予了海產品副產物更大的商業價值，且防止了這些下腳料對環境產生的不良影響，與當前大力提倡的綠色發展理念相符[15]。

3 結論

通過一系列優化試驗，明確了商業菌發酵魷魚內臟及蝦蟹下腳料的最佳條件，包括發酵溫度、料水比、菌液接種量、發酵時間。其中發酵魷魚內臟的蛋白轉化率可達20.33%；發酵蝦下腳料的蛋白轉化率可達13.18%；發酵蟹下腳料的蛋白轉化率可達12.76%。可見通過商業復合菌的發酵，可以有效轉化水產下腳料中的蛋白質等大分子營養物質，極大提升了水產下腳料的營養價值和應用前景。其中魷魚轉化率最高，對蝦其次，梭子蟹最低，說明底物本身的營養成分會對微生物發酵過程產生一定影響，后續研究或者實際應用過程中可以通過添加外源性營養物質補全底物營養源，從而更好地促進微生物生長代謝，提升發酵效率。隨著無抗時代的來臨，微生物技術逐步得到相關行業重視。微生物技術與水產行業的深度融合必將促進水產行業的多元化發展。