清胰Ⅱ號對急性胰腺炎的保護作用研究*

蔡治方，彭慈軍，傲宇，兌丹華，蘭天罡

（遵義醫學院附屬醫院 肝膽胰外科，貴州 遵義 563000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是臨床中常見的急腹癥之一，其病理特征為胰腺間質出現水腫、出血，腺泡細胞發生空泡變性、壞死或炎癥細胞大量浸潤[1]。AP因其臨床結局難以預料，嚴重威脅患者健康。清胰Ⅱ號是遵義醫學院附屬醫院經典中藥方劑，盡管許多研究表明其對AP療效顯著，但是作用機制仍不完全明確[2]。為進一步探討清胰Ⅱ號對AP的治療機制，本研究利用3%牛磺膽酸鈉經膽胰管逆行注射復制AP大鼠模型，觀察清胰Ⅱ號灌胃對AP大鼠的胰腺保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

36只清潔級SD大鼠購自第三軍醫大學實驗動物中心，許可證號：SCXK-（軍）201802154，雌雄不限制，體重210～265 g，平均（238±28）g。

1.2 實驗藥物

清胰Ⅱ號（遵義醫學院附屬醫院藥劑科自制），濃度250 mg/ml。

1.3 試劑與儀器

牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司），大鼠腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）ELISA 試劑盒（上海齊一生物科技有限公司，QY-H10038），大鼠白細胞介素6（Interleukin 6, IL-6）ELISA 試劑盒（上海易匯生物科技有限公司，ab87933），大鼠白細胞介素1β（Interleukin 1β, IL-1β）ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，AZ-003），iMARK 680通用酶標儀（美國Bio-Rad公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定、組織線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物公司，總RNA抽提試劑Trizol、dNTP、Oligo（dT）15、Taq DNA聚合酶、一抗、二抗購自上海科華生物工程股份有限公司，組織活性氧（DHE-ROS）檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司），引物設計由上海生工生物工程有限公司完成，TNF-α正向引物：5'-TTCTGTCTACTGAACTTC GGGGTGATCGGTCC-3'，反向引物：5'-GTATGAGA TAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG-3'；IL-6正向引物：5'-TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC-3'，反向引物：5'-GTGTAATTAAGCCTCCGACTTG-3'；IL-1β 正向引物：5'-GAAAGACGGCACACCCACCCT-3'，反向引物：5'-GCTCTGCTTGTGAGGTGCTGATGTA-3'；GAPDH正向引物：5'-CATGACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向引物：5'-TGAGGTCCACCACCCTGTTGCTGT-3'。

1.4 實驗分組與模型的復制

根據隨機數字表法，將36只大鼠隨機分為假手術組、模型組和干預組，每組12只。所有大鼠術前禁食12 h，10%水合氯醛（0.33 ml/100 g）麻醉后，取上腹部正中切口進入腹腔，假手術組大鼠開腹后僅翻動腸管，隨后關腹；模型組和干預組大鼠在顯露膽胰管后，采用小動脈夾暫時阻閉膽管，由十二指腸前壁斜行進針經乳頭部插入膽胰管后，勻速逆行向膽胰管內注入3%牛磺膽酸鈉（0.1 ml/100 g），夾閉膽胰管進入十二指腸的開口2 min，隨后松開小動脈夾，關腹。放入代謝籠自由飲水、禁食。

1.5 方法

1.5.1 處理方法 模型復制后，干預組大鼠給予清胰Ⅱ號灌胃（1 ml/100 g），模型組和假手術組大鼠給予生理鹽水（1 ml/100 g）灌胃，各組灌胃6 h/次，連續4次。

1.5.2 TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平檢測 采用ELISA雙抗體夾心法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平。所有大鼠處理24 h后，沿原切口進入腹腔，于下腔靜脈取血3～5 ml，迅速冰上3 000 r/min離心15 min，仔細收集上清液。采用TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒進行檢測。方法如下：設置標準孔10孔，加樣量均為50μl（根據不同試劑盒要求進行稀釋濃度），同時設置不加樣品和酶標試劑的空白對照孔，待測樣品孔中加入最終稀釋5倍的樣品，混勻后于37℃溫育30 min，隨后小心棄去液體，向每孔中加入洗滌液，靜置30 s后棄去液體，重復5次后，加入辣根過氧化物酶試劑50μl/孔，混勻后于37℃溫育30 min后洗滌，按順序加入顯色劑A、B各50μl/孔，震蕩混勻后避光顯色15 min，加入50μl終止液，于450 nm波長處測定光密度（OD）值，通過標準曲線計算TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平。

1.5.3 胰腺病理評分檢測 取胰腺組織約3 mm×3 mm×3 mm，10%甲醛固定3 h后脫水，透明、浸蠟、包埋，冷凍30 min后切片、攤烤片、脫蠟、蘇木精染色10 min，分化、復染、脫水、透明后封固，做病理學檢查，按改良的Schmidt標準法聯合Rongione法做胰腺病理評分，取3張非連續切片中3個隨機視野進行病理評分，以各評分平均值作為最終胰腺病理評分。

1.5.4 TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水 平 檢 測采用RT-PCR檢測TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA水平。取胰腺組織剪碎后冰上勻漿，在EP管中加入氯仿200μl于勻漿液中，震蕩混勻，4℃、12 000 r/min離心，取上層液加入等量異丙醇，混勻后繼續4℃、12 000 r/min離心，提取沉淀物。紫外分光光度計檢測純度。將上述引物各0.25μl加入5×buffer液5μl、Ex Taq 0.125μl、逆轉錄反應液5μl，用滅菌三蒸水調至25.5μl。PCR擴增條件：94℃變性1 min，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，72℃繼續延伸5 min。取產物5μl電泳，以GAPDH為參照，分析灰度值。

1.5.5 核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）核轉位水平檢測 采用SABC免疫組織化學法檢測NF-κB核轉位水平，取胰腺組織石蠟標本進行脫蠟、水化，以3%雙氧水去過氧化物酶封閉，加入抗NF-κB多克隆抗體（1∶100）、生物素化羊抗鼠IgG、SABC復合物，孵育后DAB染色、復染、封片。陰性對照以PBS代替一抗。每只大鼠選取5張切片，每張切片隨機選取2個高倍鏡視野觀察，以出現棕黃色顆粒為NF-κB陽性細胞。

1.5.6 胰腺組織活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）水平檢測 采用流式細胞術檢測胰腺組織ROS水平，剪取胰腺組織50 mg左右，PBS清洗后于冰上加入線粒體分離試劑A（100μl/10 mg）勻漿8～12次，4℃、3 000 r/min離心5 min，收集上清液后繼續4℃、3 000 r/min離心5 min，沉淀物即為線粒體，按1∶20加入勻漿介質，低溫勻漿10 min，收集上清液，加入DCFH-DA工作液1 mmol，混勻后37℃溫育30 min，流式細胞儀測定ROS水平。

1.5.7 Western blotting檢測 采用Western blotting檢測磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase, p-JNK, p-JNK）和總c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）水平。取胰腺組織剪碎后勻漿，加入裂解液裂解約30 min后低溫離心，測定蛋白質濃度，配置12%分離膠，取10μl樣品上樣，在80～120 V電壓下進行電泳。轉膜后加入一抗，4℃過夜。加入二抗后，37℃搖床中孵育1.5 h，進行發光顯影。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠胰腺病理評分比較

假手術組、模型組、干預組胰腺病理評分比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組胰腺病理評分低于模型組（P＜0.05），模型組胰腺病理評分高于假手術組（P＜0.05），說明模型復制成功，清胰Ⅱ號干預效果明顯，可以用于后續研究。見表1和圖1。

2.2 各組大鼠NF-κB核轉位水平比較

假手術組、模型組、干預組胞漿NF-κB水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組胞漿NF-κB水平低于假手術組（P＜0.05），但高于模型組（P＜0.05）。假手術組、模型組、干預組胞核NF-κB水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組胞核NF-κB水平高于假手術組（P＜0.05），但低于模型組（P＜0.05）。假手術組、模型組、干預組NF-κB核轉位率比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組NF-κB核轉位率低于假手術組和模型組（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

假手術組、模型組、干預組TNF-α蛋白和mRNA水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組TNF-α蛋白和mRNA水平低于模型組（P＜0.05），但高于假手術組（P＜0.05）。假手術組、模型組、干預組IL-6蛋白和mRNA水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組IL-6蛋白和mRNA水平低于模型組（P＜0.05），但高于假手術組（P＜0.05）。假手術組、模型組、干預組IL-1β蛋白和mRNA水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），干預組IL-6蛋白和mRNA水平低于模型組（P＜0.05），但高于假手術組（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠胰腺病理評分、NF-κB核轉位水平比較 （n =12，±s）

表1 各組大鼠胰腺病理評分、NF-κB核轉位水平比較 （n =12，±s）

組別 胰腺病理評分NF-κB核轉位水平胞漿NF-κB/（×102個） 胞核NF-κB/（×102個） NF-κB核轉位率/%假手術組 0.00±0.00 0.66±0.52 0.05±0.02 59.69±3.08模型組 13.17±0.72 0.42±0.05 0.20±0.02 33.37±3.53干預組 10.08±0.90 0.47±0.05 0.16±0.02 29.52±4.58 F值 1287.754 71.185 196.843 225.602 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 各組大鼠胰腺組織病理切片圖 （HE×100）

表2 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 （n =12，±s）

表2 各組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 （n =12，±s）

組別TNF-α IL-6 IL-1β蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA假手術組 6.43±1.01 2.30±0.41 1.20±0.25 3.61±1.86 23.65±7.05 44.55±10.85模型組 25.57±8.43 38.06±14.66 5.81±1.74 27.85±10.22 59.16±14.90 67.44±10.59干預組 18.51±8.53 22.36±10.65 2.28±1.33 11.13±4.27 34.60±14.07 57.73±9.64 F值 23.275 35.223 43.163 43.932 25.349 14.711 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 各組大鼠ROS、p-JNK、JNK水平比較

假手術組、模型組、干預組ROS、p-JNK、JNK蛋白水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；干預組ROS、p-JNK、JNK蛋白水平低于模型組（P＜0.05），但高于假手術組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠ROS、p-JNK、JNK水平比較（n =12，±s）

表3 各組大鼠ROS、p-JNK、JNK水平比較（n =12，±s）

組別 ROS p-JNK JNK假手術組 11.64±6.42 6.41±2.85 7.04±3.39模型組 85.99±13.53 34.82±6.64 44.40±9.40干預組 41.85±11.38 13.89±4.23 18.04±9.31 F值 142.299 111.236 41.180 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

目前，越來越多的研究表明，ROS導致的JNK信號通路激活在AP的炎癥反應中扮演重要角色[3-4]，而一系列炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等是導致AP惡化的主要因素[5]。同時，課題組前期研究結果表明，清胰Ⅱ號對AP動物模型的療效較好[6-8]，然而其是否通過抑制ROS/JNK通路導致的炎癥反應仍不清楚。因此，筆者在以往研究基礎上，進一步觀察清胰Ⅱ號對AP大鼠的治療作用，并且對其可能的機制進行探討。

研究結果顯示，假手術組胰腺病理評分低于干預組，干預組胰腺病理評分低于模型組，提示清胰Ⅱ號對AP大鼠胰腺具有一定的保護作用，與以往研究結果一致[2，6-8]。同時，本研究也發現，模型組NF-κB核轉位率高于假手術組；干預組NF-κB核轉位率高于假手術組，但低于模型組。NF-κB在正常細胞中以無活性狀態存在于細胞漿，當細胞受到特定刺激時，NF-κB迅速從細胞漿易位到細胞核，進而調控炎癥級聯瀑布反應相關酶等基因的表達，在炎癥反應中具有重要作用。由此可見，NF-κB必須發生核轉位才可以啟動下游炎癥細胞因子的表達，因此本研究以NF-κB核轉位率評價其在AP大鼠中的活化。本研究結果顯示，當大鼠發生AP時，NF-κB核轉位率增加，應用清胰Ⅱ號干預后，NF-κB核轉位率得到明顯抑制。為探討其下游炎癥因子是否受到抑制，本實驗繼續觀察TNF-α、IL-6、IL-1β水平，結果顯示，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β水平高于假手術組，干預組上述指標高于假手術組，但低于模型組。這一結果與NF-κB核轉位率的變化互相印證，說明清胰Ⅱ號能夠通過抑制AP大鼠NF-κB核轉位率，進而抑制其下游炎癥因子的表達，最終起到保護胰腺的作用。

目前研究表明，ROS與JNK相互作用可導致細胞炎癥的發生、發展[3，9]。因此，本研究選取ROS/JNK作為機制研究的觀察目標。結果顯示，模型組ROS、p-JNK、JNK水平高于假手術組，干預組上述指標高于假手術組，但低于模型組。這提示清胰Ⅱ號可能通過抑制ROS、JNK，進而減少細胞炎癥的發生。但由于ROS與JNK的作用關系較為復雜，在多數情況下，JNK接受上游ROS調控，ROS促進LNK的激活[10]。但也有學者報道，ROS產生生物活性的前提是JNK的存在，或者需要JNK的活化[11-12]。目前關于兩者間的作用關系尚未達成一致，因此清胰Ⅱ號抑制AP大鼠ROS、JNK表達的具體機制還需要進一步探索。

綜上所述，清胰Ⅱ號對AP大鼠的胰腺保護作用機制可能是通過下調NF-κB及ROS/JNK通路，降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平從而發揮作用，但由于NF-κB、ROS及JNK間存在復雜關系，對于清胰Ⅱ號治療AP的機制研究仍任重道遠。