莪術醇對結腸癌細胞HCT116的影響及作用機制研究

梁喬芳，廖小林，吳洪文*

(1.柳州市工人醫院 藥學部，廣西 柳州 545005；2.柳州市中醫院 骨科，廣西 柳州 545001)

莪術醇來源于姜科植物莪術的根莖以及郁金的根莖。莪術具有行氣破血、消積止痛的功效，主治血氣心痛、飲食積滯、脘腹脹痛、血滯經閉、痛經、瘕瘤痞塊、跌打損傷[1]。大量實驗研究發現，莪術中的莪術醇能抑制腫瘤細胞增殖，發揮較好的抗腫瘤作用[2]。B淋巴細胞瘤-2基因簡稱bcl-2(B-cell lymphoma-2)，是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。Bcl-2可與Bcl-2家族的Bax形成同源的蛋白二聚體，而特定的蛋白二聚體則可作為在細胞死亡信號通路上的分子開關。羅吉等[3]研究發現，抑制結腸癌細胞可能通過改變BCL-2、Bax水平來實現，也可通過影響Caspase家族蛋白實現抗腫瘤作用[4]。故本實驗以莪術醇為治療藥物，順鉑為陽性藥，研究其對結腸癌細胞HCT116的影響以及相關作用機制，現報道如下。

1 材料與試劑

1.1 實驗儀器

生物安全柜(BSC-1000IIA2，蘇凈安泰)；低溫高速離心機(Eppendorf 5811，德國)；二氧化碳培養箱 (SHELDON3552-2，美國)；倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71-22FL/PH，日本)；高壓蒸汽滅菌鍋(panisonic mLS-3751L-pc，日本)；恒溫干燥箱(ZBY149-83，上海躍進醫療器械廠)全波長酶標儀(Thermo Scientific 1510，美國)；超純水儀(CD-UPW-IV，成都越純科技有限公司)；冰箱(博世冰箱BCD-254，德國)；超低溫冰箱(Thermo Scientific Forma 900，美國)；恒溫水浴鍋(ZSXH-618，上海智城分析儀器制造有限公司)；液氮罐(ThermoFisherBio，美國)。

1.2 細胞株

人結腸癌細胞株HCT116購自于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

1.3 藥品與試劑

莪術醇(批號：20180525，純度≥98.0%，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司)； RPMI 1640培養液(廣州潔特生物過濾股份有限公司，批號：180301-377)； Hank’s Balanced Salt Mixture(索萊寶，批號20180429)；胰酶(Gibco，美國)；青鏈霉素混合液(索萊寶，批號20180512)；胎牛血清(四季青，批號20180518)；CCK8(日本同仁)；BAX(批號AA368876)、Bcl-2(批號AA656642)、Caspase9(批號AA126876)兔抗人單克隆抗體、二抗為抗兔(批號AA126544)，均購自bioworld公司。FDA染色劑(Sigma公司，批號：F7378)；順鉑注射液(山東齊魯制藥有限公司，批號：6A002A88)；BCA試劑盒、ECL發光液均購自上海碧云天有限公司。

2 方法

2.1 HCT116結腸癌細胞的培養

用長鑷子從液氮罐里取出裝有HCT116的凍存管，在37 ℃水浴鍋里，搖晃1 min，使之全部融化，然后加入一定量的含10%的血清和1%青鏈霉素混合液的高糖培養基(完全培養基)，1 000 r/5 min離心，棄去上清液，加入完全培養基，吹打混勻后移至培養瓶，在37 ℃，5%CO2無菌培養箱里培養，一般4 h細胞完全貼壁，48 h后傳代。丟棄細胞培養廢液，用Hank's清洗兩遍，注意動作輕柔，防止洗掉貼壁細胞，加入適量胰酶并在顯微鏡下觀察，等到細胞開始變得圓潤并且開始脫落，加入完全培養基終止消化，1 000 r/5 min離心，加入完全培養液分裝至培養瓶。一般穩定傳2～3代后，即可用細胞開展實驗。

2.2 莪術醇對HCT116結腸癌細胞增殖的影響

取對數生長細胞，按照8×103個細胞接板至96孔板，每孔加100 L，分為空白對照組、陽性藥組、莪術醇高、中、低組，6個復孔。空白組加不完全培養液，陽性藥組加含有5 μmol/L 順鉑的不完全培養液，給藥組分別加100、50、25 μg/mL的莪術醇，37 ℃，5%CO2孵育24 h，分別加入以上對應組，24 h后加入10% cck8，1h后在450 nm測得OD值。按照以下公式計算出存活率，其中細胞存活率=(劑量組OD值-對照組OD值)/對照組OD值× 100%。

2.3 不同劑量的莪術醇對HCT116結腸癌細胞的FDA染色

取對數生長細胞，按照每孔4×106個細胞接板至6孔板，每孔加2 mL，分為對照組，陽性藥組，10、25、100 μg/mL 莪術醇劑量組，共5個組，3個復孔。37℃，5%CO2孵育24 h，對照組只加不完全培養液，3 h后，棄去所有培養液，用Hank’s輕柔清洗兩遍，給藥組分別給予對應劑量藥物，FDA染色后，熒光顯微鏡觀察細胞生長形態學特征并拍照。

2.4 Western Blot法檢測不同劑量莪術醇干預HCT116結腸癌細胞BCL-2、BAX、Caspase9蛋白表達

2.4.1 細胞處理 細胞穩定傳代后，加完全培養液，細胞鋪滿培養瓶，空白組不完全培養液，陽性藥組和莪術醇組分別用不完全培養液稀釋藥物。劑量按照“2.2”項下方法設計。干預24 h后，棄去培養液，以Hank’s輕柔清洗兩遍，胰酶消化后，離心收集細胞。每管加入1 mL裂解液，充分震蕩后，冰水里裂解30 min，取上清液轉移至新的EP管中。

2.4.2 蛋白含量測定 取5 mg/mL BSA(牛血清白蛋白)標準品10 μL用去離子水稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL。分別取標準品0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液(去離子水或PBS緩沖液)補足至20 μL，此時BSA標準品濃度分別為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/μL。加適當體積樣品至96孔板的樣品孔中，若樣品不足20 μL，需加標準品稀釋液(去離子水)補足至20 μL，記錄待測孔所加樣品的體積。加200 μL顯色液，孵育15 min，采用酶標儀檢測，計算蛋白含量并確定最終上樣量。

2.4.3 樣品處理 使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，按照樣本∶緩沖液=4∶1混勻，沸水煮20 min，放室溫后轉移到-20℃冰箱保存。

2.4.4 制膠 本實驗選用12%壓縮膠，5%分離膠。

2.4.5 上樣與電泳 將樣本拿出恢復到室溫后，震蕩混勻后，將蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。 本實驗采用SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常電壓設置為100 V，1 h。

2.4.6 轉膜 使用0.22 μm的PVDF膜，設定轉膜電壓為110 V，轉膜時間為110 min。在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發熱現象，故將轉膜槽放置在冰浴中。

2.4.7 封閉 轉膜完畢后，立即將蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液(1X TBS-T溶液)中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的轉膜液。轉膜完畢后應特別注意膜的保濕，避免膜干燥，否則極易產生較高的背景。用滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液(5%脫脂奶粉)，在搖床上緩慢搖動，37 ℃封閉1 h以上，室溫封閉2 h以上。對于一些背景較高的抗體，可以4 ℃封閉過夜。

2.4.8 一抗孵育 參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液(1X TBS-T溶液)稀釋一抗。封閉后，棄去封閉液，1X TBS-T溶液洗膜，洗去封閉液即可。

2.4.9 二抗孵育 加入稀釋好的二抗，室溫或4 ℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育2 h，37 ℃下1 h。 回收二抗，加入1X TBS-T溶液，在搖床上緩慢搖動洗滌5～10 min。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5～10 min。共洗滌3次。若結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

2.4.10 蛋白檢測 本步驟稱為曝光、洗片、顯色或顯影。采用化學發光法進行顯色，將孵育二抗并清洗完畢的PVDF膜置于天能5300凝膠成像系統內。取等體積的發光液A和發光液B混勻，均勻撒在PVDF膜上，運行凝膠成像系統的軟件，選擇化學發光，設置曝光時間，拍照并保存。

2.5 統計學方法

實驗數據采用SPSS22.0進行統計學處理，用t檢驗分析各個組之間的差異，求得標準偏差表示其浮動范圍，求得P值，按照P<0.05標準判定組間有差異。

3 結果

3.1 莪術醇對HCT116結腸癌細胞增殖的影響

不同劑量莪術醇對HCT116細胞干預24 h后，對其抑制率有不同的影響。干預濃度升高，對細胞的抑制率也升高。其中陽性藥組細胞存活率為22.5%，高、中、低莪術醇劑量組細胞存活率分別為35.4%、58.2%、83.1%。 具體見表1。

表1 不同組別結腸癌細胞活性比較

3.2 莪術醇對HCT116結腸癌細胞BCL-2、BAX、CasPase9蛋白表達的影響

圖1A為各組蛋白電泳圖，B、C、D分別為BAX、CasPase9、BCL-2蛋白表達水平柱狀圖。與空白組相比，陽性藥組細胞Bax、casPase9表達水平顯著提高(P<0.01)，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.01)，莪術醇高、低劑量組細胞BAX水平顯著提高(P<0.05)，莪術醇高、中劑量組細胞casPase9水平顯著提高(P<0.01)，Bcl-2水平顯著降低(P<0.01)。見表2。

圖1 不同組別 BAX、Caspase9、BCL-2蛋白表達水平

表2 不同組別結腸癌細胞 BAX、Caspase9、BCL-2蛋白表達水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 不同組別結腸癌細胞FDA染色

空白組細胞生長密集，陽性藥物組細胞稀疏，效高、中、低劑量莪術醇組細胞分別呈密集到稀疏趨勢。具體見圖2。

圖2 不同組別HCT116結腸癌細胞FDA染色

4 討論

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，好發于直腸與乙狀結腸交界處，以40～50歲年齡段發病率最高，男女比例為2～3∶1，發病率為胃腸道腫瘤的第3位。結腸癌主要為腺癌、黏液腺癌、未分化癌，大體形態呈息肉狀、潰瘍型等。結腸癌可沿腸壁環行發展，沿腸管縱徑上下蔓延或向腸壁深層浸潤，除經淋巴管、血流轉移和局部侵犯外，還可向腹腔內種植或沿縫線、切口面擴散轉移。

研究發現，莪術醇能明顯抑制結腸癌細胞增殖，并且可能對凋亡蛋白有一定影響。細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，其涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用。細胞凋亡并不是病理條件下自體損傷的一種現象，而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。Bcl-2家族、caspase家族與細胞凋亡密不可分。

本研究結果表明，莪術醇能提高結腸癌細胞HCT116凋亡蛋白BAX、Caspase9的表達，降低抗凋亡蛋白BCL-2的表達[5-6]，且在CCK8細胞活性檢測以及FDA染色中表現出較好的抑制作用及形態學變化。綜上所述，莪術醇對結腸癌細胞HCT116有一定抑制作用，可能是通過影響凋亡蛋白的表達而發揮抗癌作用。