橢圓葉花錨對小鼠急性肝損傷的保護作用

段向蘭，王 洋，尚 軍

(青海師范大學 生命科學學院，青海 西寧 810008)

橢圓葉花錨(HaleniaeliPticaD.Don)藏名甲地然果，屬龍膽科花錨，根據記載，該藥以全草入藥，味苦、性寒，具有清熱利濕、平肝利膽的功效，可用于急性黃疸性肝炎、膽囊炎、頭暈頭痛、牙痛的治療[1]，也可用于治療外傷感染、脈熱[2]等疾病，是傳統藏醫臨床上治療肝膽疾病的常用藥物之一。花錨的主要化學成分為呫噸酮及其苷、裂環烯醚萜類、三萜類及黃酮苷等化合物[3-4]，還含有齊墩果酸。已有大量研究證實齊墩果酸具有清熱、消炎、抑菌、保肝、護肝、增加白細胞、降低轉氨酶等作用[5]，是橢圓葉花錨的主要藥效物質之一。

肝臟是人體內最大、功能最多的實質性腺體器官，被喻為“人體最大的化工廠”。主要參與體內消化、代謝、排泄、解毒和免疫的過程，是具有重要而復雜代謝功能的器官[6]。肝損傷主要包含病理性、化學性及外傷性損傷。病理性的肝損傷主要是由各種病毒病菌引發，可表現為肝纖維化、肝硬化、肝細胞壞死等其他癥狀。化學性肝損傷主要是指使用化學物質過多或機體過敏等原因所導致的體內環境的紊亂。外傷性肝損傷是臨床上常見的急重癥之一，患者的肝實質往往受到較嚴重的損傷，且同時伴有不同程度的肝內外血管受損，往往會導致患者出現腹腔內積血，引發失血性休克，對其生命安全造成嚴重威脅[7]。目前在臨床上最常見的肝損傷案例以病毒性、化學性為主，外傷性肝損傷較為少見。近年來肝病發病率逐年上升[8]，已嚴重危害人類的身體健康。近現代藥理研究表明，花錨及復方花錨具有調節體液免疫的作用，且全草的氯仿提取部分具有抗阿米巴作用，對治療肝損傷有一定的療效[9]。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

KM小鼠50只，體重(20±2)g，雌雄各半，購于蘭州大學，許可證：scxk(甘)2013-0002。

1.2 試劑

四氯化碳(CCl4)溶液；玉米油(秦皇島金海食品工業有限公司)；聯苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業股份有限公司)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒、天門冬氨酸轉移酶(AST)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗儀器與設備

奧豪斯AdventurerTM電子天平；粉碎機；萬用電爐；自動攪拌器；R-210旋轉蒸發儀；華普達數顯恒溫水浴鍋；電熱鼓風干燥箱；XTP-500型高速多功能搖擺粉碎機；Bio-Rad XMARK酶標儀；TD3低速離心機；海爾冰箱；微量加樣器；微量振蕩器。

2 實驗方法

2.1 橢圓葉花錨醇/水提取物制備

取橢圓葉花錨1.5 kg，全草粉碎過100目篩，將粉碎物與75%乙醇/蒸餾水1∶6混合，浸泡3 h后煎煮3次，每次微沸1 h，取上清液合并濃縮，水浴鍋90 ℃條件下濃縮至固體，干燥后研磨成粉并配制成所需濃度的溶液，置于4 ℃冰箱待用。

2.2 四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝損傷模型制備

在參考文獻[10-11]的基礎上，觀察KM小鼠處于正常狀態，適應性飼養7天后。隨機分成8組，雌雄各半，每組80只。分別為空白對照組，聯苯雙酯陽性對照組(0.2 g/kg)，橢圓葉花錨乙醇提取物和水提取物低(0.5 g/kg)、中(2.5 g/kg)、高劑量組(12.5 g/kg)。連續給藥7天，末次給藥1 h后，空白對照組小鼠腹腔注射等體積的橄欖油(0.2 mL/10g)，其他組均注射CCl4(0.1%，0.2 mL/10g)，18 h后對小鼠摘眼球取血，3 000 r·min-1離心10 min取上血清，采用試劑盒測定相關指標，進行比較分析。

3 結果

3.1 橢圓葉花錨對肝損傷小鼠體內血清中ALT、AST含量的影響

末次給藥12 h后摘眼球取血，離心后測定血清中ALT、AST含量。結果如表1所示。與正常對照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST含量顯著升高(P<0.01)，造模成功。與模型組比較，橢圓葉花錨醇提物和水提物的3個劑量均對小鼠體內ALT、AST水平有影響。其中低、中、高劑量醇提物使小鼠血清中ALT含量分別減少了27.09%、29.11%和31.16%。低、中、高劑量水提物小鼠血清中ALT含量分別減少了23.76%、27.42%和30.29%。高、中劑量橢圓葉花錨醇提物和水提物對小鼠ALT、AST含量影響顯著，差異具有統計學意義(P<0.05)。

此外，橢圓葉花錨提取物對小鼠血清中AST含量也有一定影響，且醇提物影響最為明顯。低、中、高劑量醇提物使小鼠血清中AST含量分別減少了24.81%、35.66%和39.69%。低、中、高劑量水提物使小鼠血清中AST含量分別減少24.93%、35.37%和37.66%。除橢圓葉花錨水提物低劑量組效果不顯著外，其他藥物組對小鼠體內AST的影響均具有統計學意義(P<0.05)。

表1 橢圓葉花錨對CCl4致肝損傷小鼠ALT、AST活性的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 橢圓葉花錨對肝損傷小鼠體內血清中MDA的影響

如表2所示，模型組小鼠血清中MDA含量較空白組明顯升高，各藥物組均能降低小鼠體內MDA含量。其中，低、中、高劑量橢圓葉花錨醇提物使小鼠MDA含量分別減少了21.49%、33.09%和34.64%，與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。除水提物低劑量組外，中、高劑量橢圓葉花錨水提物組小鼠MDA含量分別減少了23.48%和37.24%，與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。其中高劑量橢圓葉花錨醇提物和水提物對小鼠血清中MDA的影響最為顯著(P<0.01)。

表2 橢圓葉花錨對CCl4致肝損傷小鼠血清MDA含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

四氯化碳誘導的肝損傷模型包括急性肝損傷和慢性肝損傷兩種，該方法也可用于多種實驗動物肝損傷模型的建立。CCl4致肝損傷經典模型通常用于評價藥物對肝損傷是否有保護作用[12]。ALT和AST主要分布于肝臟，是診斷肝臟疾病最常用的酶，當肝臟受到一定損傷時，細胞膜的通透性增加，使ALT、AST外泄至血清。MDA是自由基引起的脂質過氧化過程中生成的一種醛類物質，MDA水平升高，SOD活性降低，可引發氧化應激反應，導致細胞損傷甚至細胞凋亡，因此可根據小鼠血清中ALT、AST和MDA含量的變化，以判斷橢圓葉花錨是否具有保肝降酶作用[13]。

本實驗建立CCl4小鼠急性肝損傷模型，將KM小鼠分組后分別注射高、中、低劑量橢圓葉花錨醇提取物和水提取物，通過檢測KM實驗小鼠血清中的ALT、AST和MDA含量，討論各給藥組對小鼠化學性肝損傷的保護作用。

根據實驗結果，首先對模型組與空白組小鼠的指標數據進行比較，差異具有統計學意義(P<0.01)，表明此次肝損傷造模成功。其次，橢圓葉花錨高、中、低劑量醇提物和水提物均可使CCl4誘導的肝損傷小鼠血清中ALT、AST及MDA含量降低，且高劑量組效果最為顯著(P<0.01)，說明橢圓葉花錨具有一定的保肝降酶的作用。橢圓葉花錨水提物和醇提物的保肝作用在設定濃度范圍內呈現出隨劑量增大而作用增強的效果，且醇提物較水提物的保肝作用略為明顯。因此，今后的研究可進一步探索橢圓葉花錨的保肝作用，為臨床藏藥的開發使用以及藥物篩選提供參考。