響應曲面法優化篤斯越橘花青素提取工藝

胡立紅，孫 萍

(1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.江中藥業股份有限公司，江西 南昌 330049)

花青素(anthocyanidin)作為一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，具有類黃酮的典型結構[1-3]，是一種天然抗氧化劑，具有抗衰老、清除自由基、抗炎、調節血脂、抗癌、改善視力等多種功能[4-6]。與合成色素比較，天然色素安全性較高，對人體的危害相對較小[7]，歐洲將花青素含量≥24%的色素提取物作為藥用，其中歐洲越橘(品種VmyrtillusL.)花青素的提取物(myrtocyan)已被意大利、德國等國家的藥典收載[8]。近年來研究陸續證明花青素具有一系列生理保健功效，篤斯越橘作為果蔬中含抗氧化成分最豐富的一種資源，抗氧化能力很強，并具有促進視紅素再合成、抗炎抗菌、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老和抑制癌癥細胞發生等藥理學功效[9-11]。

由于篤斯越橘在所有果蔬中花青素含量最高[12]，且我國的篤斯越橘種植產業發展迅速，以篤斯越橘為原料生產花青素具有較好的資源優勢。目前關于篤斯越橘花青素的研究主要涉及提取純化工藝技術以及穩定性試驗方面，絕大多數試驗以篤斯越橘鮮果為實驗對象，而篤斯越橘作為季節性水果且不易保存，不利于工業大規模生產。因此，筆者以篤斯越橘凍干粉為原料，以篤斯越橘凍干粉為原料，結合單因素試驗和 Box-Behnken 設計及響應面試驗方法優化用乙醇浸提法提取篤斯越橘花青素的工藝條件，為篤斯越橘花青素的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

篤斯越橘凍果：品種為篤斯越橘，經鑒定為杜鵑花科越橘屬(Vaccinium Spp)漿果類植物果實，產自大興安嶺，-10℃保存備用。

試劑：濃鹽酸；甲醇(分析純)；藥用乙醇(山東龍玉泉藥用輔料有限公司)；飛燕草素對照品(美國ChromaDex公司，批號00004125)。

1.2 儀器與設備

AB204-S型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-4型數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；UV-1800型紫外可見分光光度計(日本SHIMADZU公司)；TL-5.0臺式離心機(上海市離心機械研究院)；LGJ-30F型冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)；Delta 320 pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理 挑選成熟度均一的篤斯越橘凍果，解凍、清洗、瀝干、打漿。將果漿冷凍干燥機中預凍4 h后，凍干36 h，粉碎，過80目篩，制成凍干粉，于-10℃密封避光保存備用。

1.3.2 對照品溶液制備 精密稱取飛燕草素對照品5 mg，置于25 mL容量瓶中，加2%鹽酸-甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻，再精密量取1 mL至25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇稀釋至刻度線，搖勻，即得。

1.3.3 供試品溶液制備 取篤斯越橘凍干粉，精密稱定，放置于100 mL棕色容量瓶中，加入一定體積和確定pH值的乙醇溶液，置于預先設定好的水浴溫度下浸提一段時間。提取結束后，將提取液倒入離心管中，置于冷凍離心機中以4 000 r·min-1離心10 min。取上清液10 mL，用2%鹽酸-甲醇稀釋至適量，于80 ℃水浴30 min，冷卻。用2%鹽酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，取5 mL于25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 標準曲線建立 精密稱取飛燕草素對照品適量，加2%鹽酸-甲醇制成飛燕草素質量濃度為1.10、3.31、5.52、6.62、8.83 μg/mL的對照品溶液。以2%鹽酸-甲醇溶液為空白，采用紫外-可見分光光度法，于540 nm波長處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標，飛燕草素濃度為橫坐標，得回歸方程為y=0.1023x+0.0105，R2=0.99996，飛燕草素在1.104～8.832 μg/mL濃度范圍內與其吸光度值線性關系良好。

1.3.5 樣品測定 以2%鹽酸-甲醇為空白溶劑，取供試品溶液適量于540 nm測定吸光度，計算樣品中飛燕草素的質量濃度。花青素的含量以飛燕草素的質量分數計[13]。

1.3.6 花青素提取率計算

1.3.7 單因素試驗設計 在預實驗的基礎上，對乙醇體積分數、料液比、提取溫度、提取時間和pH值5個因素進行單因素試驗，提取劑乙醇的體積分數分別為40%、50%、60%、70%、80%，料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，水浴溫度為35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃，提取時間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，pH值為1.00、1.50、2.00、2.50、3.00。所有試驗數據均為3次重復試驗所得的平均值。

1.3.8 響應面法實驗設計 在單因素試驗結果的基礎上，以乙醇的體積分數、料液比和提取溫度為自變量，花青素提取率為響應值。根據Box-Behnken試驗設計，優化出乙醇浸提篤斯越橘花青素的最佳工藝參數。因素水平設計如表1所示。

表1 試驗設計因素水平及編碼

1.3.9 數據處理 所有試驗重復3次，對每組實驗數據進行方差分析，采用SPSS19.0軟件分析結果的顯著差異；采用 Design Expert ver8.0軟件設計組合試驗。

2 結果與分析

2.1 乙醇浸提條件對篤斯越橘中花青素提取率的影響

2.1.1 乙醇體積分數的影響 乙醇具有安全低毒、成本低的優點，且極性較大，故提取效率高，是提取黃酮類化合物常用的溶劑。乙醇的體積分數對篤斯越橘花青素提取率的影響如圖1所示。隨著乙醇體積分數的增大，花青素提取率呈先增加后減少的趨勢，當乙醇體積分數為50%時，篤斯越橘花青素提取率最高，究其原因可能是根據相似相容的規則，花青素易溶于極性大的溶劑中，因此乙醇濃度增大，其極性增大，從篤斯越橘中提取花青素效率會達到一個閾值，但當乙醇提取分數繼續增大時，提取劑極性相對變小，偏離了篤斯越橘花青素的極性，從而降低了花青素的溶出[14]。因此，當提取溶劑的極性與花青素極性一致時，其提取效果最高。

圖1 乙醇體積分數對篤斯越橘花青素提取率的影響

2.1.2 料液比的影響 如圖2所示，花青素的提取率隨著料液比的增大出現先變高后降低的趨勢，這是因為提取溶劑用量增多，篤斯越橘凍干粉與溶劑接觸面積增加，更有利于花青素的溶出，當達到飽和狀態時，增大溶劑用量，會提取出不必要的雜質和增加成本[15]；另一方面是因為提取溶劑用量增加會導致色素濃度降低，從而使分子間作用力降低，直接降低花青素穩定性[16]。

2.1.3 提取溫度的影響 如圖3所示，隨著提取溫度升高，花青素提取率提高，提取溫度若繼續提高，花青素提取率反而會降低。筆者認為造成原因如下：①提取溶劑會揮發且花青素對熱敏感，會發生降解；②溫度升高，花青素易被氧化，結構被破壞[17]；③花青素在低溫時穩定。

圖2 料液比對篤斯越橘花青素提取率的影響

圖3 溫度對篤斯越橘花青素提取率的影響

2.1.4 提取時間的影響 花青素是一類不穩定的物質，容易受溫度、氧氣、光照等影響，因此在提取花青素的過程中，提取時間的影響不可忽視。由于花青素的不穩定性，在一定提取時間范圍內，其提取效率會達到最大值，而后下降，如圖4所示。具體原因如下：①由于空氣氧化作用導致花青素分解從而導致含量降低；②花青素隨提取時間延長而不斷溶出，當溶解達到飽和，提取效率不再增大；③花青素的熱穩定性差；④提取時間過長，易產生雜質，降低花青素的純度。

圖4 提取時間對篤斯越橘花青素提取率的影響

2.1.5 pH的影響 一般情況下，花青素在酸性條件下更穩定[18]，因此pH通常控制在0.5～3，通常使用的酸化劑為酒石酸、鹽酸等。從結構上來看，在酸性條件下，花青素以藍色醌式堿(A)、紅色黃洋鹽陽離子(AH+)、無色甲醇假堿和查耳酮4種形式存在。隨著酸性逐漸變弱，花青素結構由有色的AH+轉變為A直到無色甲醇假堿型占據主導地位。pH過高，花青素會裂解為花色素基元及糖基兩部分，導致花色苷穩定性下降；而pH過低可能使花青素的糖基水解，也會導致花青素的穩定性下降[19-20]。具體變化如圖5所示。

2.2 響應曲面法試驗結果

2.2.1 Box-Benhnken設計試驗結果 根據Box-Benhnken試驗設計原理，選擇乙醇體積分數、料液比和溫度3個因素，對篤斯越橘花青素提取工藝進行17次試驗點的響應面分析實驗。結果見表2。

圖5 pH對篤斯越橘花青素提取率的影響

表2 響應曲面法試驗設計及結果

2.2.2 響應面回歸模型 由表3可知，建立篤斯越橘花青素提取率回歸模型的P<0.01，表明回歸模型高度顯著，失擬項P=0.0502>0.05，模型失擬項不顯著，表明模型擬合良好，實驗誤差小，即試驗數據有意義，可用以預測各因素對篤斯越橘花青素提取率的影響。根據表4中各因素P值的大小可知，各因素對篤斯越橘花青素提取影響程度大小為溫度>乙醇體積分數>料液比，且乙醇體積分數和料液比交互作用、料液比和溫度交互作用、乙醇體積分數的二次項、料液比的二次項對篤斯越橘花青素的提取率也存在顯著影響。剔除模型中不顯著項，得到篤斯越橘花青素提取率的回歸方程，即Y=57.58+1.11×A+0.57×B-1.41×C+3.39×A×B+0.52×A×C+4.04×B×C-7.04×A2-6.76×B2-2.54×C2。其中，A為乙醇體積分數(%)，B為料液比(g/mL)，C為溫度(℃)，Y為花青素提取率(%)。

2.2.3 篤斯越橘花青素提取率的響應面分析 依據響應曲面得到的回歸方程，建立花青素提取率與試驗因素的三維空間的曲面圖，確定花青素提取率最大的工藝條件。如圖6所示，A圖表示當溫度為65℃時，考察乙醇體積分數和料液比對花青素提取率交互影響，B圖表示當乙醇體積分數為50%水平時，考察料液比和溫度對花青素提取率交互影響。

根據表3中各因素P值的大小可知，乙醇體積分數和料液比以及料液比和溫度的交互作用顯著影響花青素的提取率(P<0.05)，其余因素的交互作用不明顯(P>0.05)。等高線的形狀反映交互作用的強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示交互作用顯著。從A、B圖可見：等高線呈現圓形，略有些橢圓，響應面坡度陡，說明兩因素的交互作用對花青素的提取率影響較顯著。

表3 回歸模型系數的顯著性檢驗

圖6 篤斯越橘花青素提取率的響應面分析

2.3 最優工藝參數優化

在建立篤斯越橘花青素乙醇體積分數、料液比、溫度的回歸模型的基礎上，采用中心組合試驗設計(Central Composite Design)對乙醇提取篤斯越橘花青素的工藝參數進行優選組合，優化后的工藝參數和最優結果如表4所示。

表4 優化結果和驗證值

以篤斯越橘花青素提取率最高為導向，所得的最優工藝參數為：乙醇體積分數為50%、料液比為1∶30、溫度為62 ℃、提取時間為60 min、pH=1.50。在最優工藝條件下進行驗證試驗，經過3次試驗確定的最優結果為58.76%，并且高于響應曲面優化值57.82%，表明了優化結果的合理性，并且進一步驗證了回歸模型的適用性。

3 結論

本研究以篤斯越橘凍干粉為原料，以乙醇為提取溶劑，結合單因素試驗結果進一步通過Box-Benhnken 設計及響應面試驗，得到篤斯越橘花青素的最優提取工藝條件為乙醇體積分數50%，料液比1∶30，溫度62 ℃，提取時間60 min，pH=1.50。在此工藝條件下驗證試驗的篤斯越橘花青素提取率可達58.76%，與預測值(57.82%)無顯著差異，表明建立的模型能較好地預測篤斯越橘花青素的提取率。

前期采用酶法提取花青素，但花青素在無細胞壁包裹的條件下極不穩定，且在實際生產中增加了生產成本。因此，本試驗采用乙醇浸提的方法，由于花青素本身性質不穩定，限制其市場應用，因此花青素的穩定性以及在生產中采取一定的穩定化技術將是我們后續對篤斯越橘花青素的研究重點。