三種工藝提取丹參有效成分及丹酚酸B分離純化研究

鄒蔓姝，韓遠山，王宇紅

(1.湖南中醫藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；3.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

丹參(Salviamiltiorrhiza)為唇形科鼠尾草屬植物丹參干燥的根及根莖，始載于《神農本草經》，列為上品[1]。丹參具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩等功效，為活血化瘀的著名中藥[2]。現代藥理學研究表明，丹參中作用于心血管的主要有效成分為水溶性酚性物質[3-4]，其中尤以丹酚酸B含量最高，活性最強。傳統丹酚酸的提取方法為水回流提取，得到的水溶性雜質多，且純化工藝步驟繁瑣，操作復雜，成本高[5]。大孔樹脂是近年來發展起來的一種以吸附和分子篩原理相結合的分離材料，具有穩定性高、選擇性好、再生處理方便、吸附速率快、不受無機鹽類、強離子和低分子化合物影響的優勢[6-8]。利用大孔樹脂吸附分離技術對丹參提取液進行分離純化，以丹酚酸B含量為指標，通過靜態和動態吸附-解吸附變化，考察最佳分離純化條件，并優化其工藝，現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AY120 Shimadzu電子分析天平(Shimadzu Corporation Japan)；98-1C型數字控溫電熱套(天津市斯特儀器有限公司)；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-52A )；TL9900數據處理軟件；SK2200HP超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率30 kHz)；PHS-25酸度計(上海雷磁儀器廠)；TU-1901型雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器責任有限公司)；Agilent1100高效液相色譜儀(美國HP公司)；Hypersil BDS C18色譜柱(Thermo)(4.6 mm×200 mm，5 μm)；HA121-50-01型超臨界萃取裝置(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)；SA-6000自動血流變測試儀(北京賽科希德科技發展有限公司)。

1.2 試劑

丹參酮IIA(批號：110766-201520，中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%)；丹酚酸B(批號：111562-201615，中國食品藥品檢定研究院，純度≥99%)；丹參藥材(由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供)；色譜甲醇(SPECTAUM)；色譜乙腈(SPECTAUM)；冰醋酸(湖南匯虹試劑有限公司)；大孔吸附樹脂：D101(天津農藥股份有限公司)；HPD100，HPD600(滄州寶恩化工廠)；AB-8，NK-II，SIPI905(南開大學化工廠)。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠48只，體重180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(動物許可證號 SCXK(湘)2013-0004)。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

2.1.1 乙醇超聲提取 參照《動植物藥有效成分提取分離和藥理活性篩選匯編》方法[9]，取丹參藥材100 g，加10倍量乙醇浸泡12 h，再加5倍乙醇超聲提取2次，每次1h，合并提取液，減壓濃縮至干，加水溶解后，采用大孔樹脂吸附純化，以50%乙醇洗脫，得洗脫液，減壓濃縮至干，編號為①。

2.1.2 不同濃度乙醇提取 參照《中國藥典》2015年版一部復方丹參片中丹參提取方法，取丹參藥材100 g加8倍量乙醇回流提取1.5 h，過濾，濾液回收乙醇，減壓濃縮至干，備用；藥渣加6倍量50%乙醇回流提取1.5 h，過濾，濾液回收乙醇，減壓濃縮至干，備用；藥渣加6倍量水提取2 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，備用；合并上述浸膏，編號為②。

2.1.3 SFE-CO2萃取 取丹參藥材100 g，采用SFE-CO2萃取，以萃取壓力22 MPa、溫度40 ℃、解析壓力22 MPa、溫度40 ℃、夾帶劑為30%藥材量的乙醇的條件對丹參脂溶性成分進行萃取，得萃取物備用；藥渣同“2.1.1”項下處理，所得浸膏與萃取物合并，編號為③。

2.2 三種工藝樣品的化學成分比較

以丹參酮IIA和丹酚酸B的提取量為考查指標，對3種工藝制備的樣品進行化學成分比較研究。參照中國藥典2015年版一部丹參項下丹酚酸B、丹參酮IIA含量測定方法進行檢測。

2.2.1 色譜條件 丹酚酸B：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.02%磷酸水為流動相，進行梯度洗脫；柱溫為20 ℃；檢測波長為270 nm。丹參酮IIA：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸水(22∶78)；柱溫為20 ℃；流速為1.2 mL/min；檢測波長為286 nm。兩者理論塔板數均不低于6 000。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B對照品10 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇-水(8∶2)至刻度，搖勻，即得(丹酚酸B濃度0.1 mg/mL)。精密稱取丹參酮IIA對照品10 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；精密量取2.5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(丹參酮IIA濃度20 μg/mL)。

2.2.3 供試品溶液制備 取上述3種樣品浸膏，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 測定法 分別精密吸取兩種對照品溶液與三種供試品溶液各10 μL，依次注入液相色譜儀，測定，即得。結果表明，采用SFE-CO2萃取后藥渣再醇提的方法優于其他兩種提取方法。見表1。

表1 不同提取方法對提取率的影響

注：指100g丹參藥材中丹酚酸B、丹參酮IIA的提取量；丹參藥材中丹酚酸B的含量不少于3.0%、丹參酮IIA的含量不少于0.25%。

2.3丹參不同提取液對大鼠血液流變學參數的影響

2.3.1 動物造模方法及分組 先給予大鼠皮下注射大劑量腎上腺素模擬暴怒時機體狀態，再以冰水浸泡模擬寒邪侵襲，二者綜合作用可迅速復制出血液流變性呈黏、濃、凝、聚的模型[10-12]。因血瘀模型形成較迅速，故采用預防性實驗治療[13]，即先給藥7 d，待活血化瘀作用出現時，再開始造模。取雄性SD大鼠48只，按體重隨機分為空白對照組，血瘀模型組，陽性藥物組(復方丹參片)，丹參①、②、③組。給藥組每日灌胃給藥1次，連續給藥7 d，空白對照組和血瘀模型組大鼠給予等體積生理鹽水。第7 天給藥1 h后，除空白對照組外，其他各組大鼠均皮下注射鹽酸腎上腺素注射液0.08 mL/100 g，共2次，每次間隔4 h，在兩次注射之間，將大鼠放入0℃冰水中，浸泡5 min后取出。空白對照組大鼠皮下注射等體積的生理鹽水，且不放入冰水中。

2.3.2 測定指標 所有大鼠禁食12 h，次晨股動脈采血，3% EDTA抗凝，測定纖維蛋白原，另用肝素抗凝，采用血流變測試儀測定血液流變學指標。

2.3.3 結果 模型組大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積指數高于正常對照組。與模型組相比，藥物組大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積指數、纖維蛋白原，紅細胞聚集指數等明顯降低。組間比較可得，丹參①和丹參③具有較好的改善血液流變學的作用，兩者之間無顯著性差異(P<0.05)，但效果皆明顯優于丹參②。考慮工藝的簡化和穩定以及節約成本因素，宜選擇乙醇超聲提取。見表2、表3。

表2 丹參不同提取液對大鼠血液流變學參數的影響

注：與空白對照組比較，++P<0.01，+P<0.05；血瘀模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

表3 丹參不同提取液對大鼠血液流變學參數的影響

注：與血瘀模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

2.4 樣品制備與大孔吸附樹脂前處理

2.4.1 供試品溶液制備 取“2.1.1”項下干浸膏粉末，加水溶解成濃度為0.3 g生藥/mL(含丹酚酸B為9.9 mg/mL)的供試品溶液備用。

2.4.2 對照品溶液的制備 取丹酚酸B對照品，加蒸餾水制成0.12 mg/mL濃度的溶液，備用。

2.4.3 大孔樹脂前處理 稱取適量各型號大孔樹脂，無水乙醇浸泡24 h后裝柱，加乙醇靜止浸泡4 h后，以2 BV/h流速通過樹脂柱至洗脫液加水不出現白色渾濁，蒸餾水洗至無醇味；5%HCl浸泡洗脫4 h，體積流量4 BV/h，蒸餾水洗至流出的洗脫液呈中性，0.2%NaOH浸泡洗脫4 h，體積流量4 BV/h，蒸餾水洗至流出的洗脫液呈中性。

2.5 丹酚酸B含量測定

分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別于286 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.03824X+0.001 7，相關系數r2=0.9995，表明丹酚酸B在10.0～90.0 μg/mL濃度范圍內與吸光度值線性關系良好。

2.6 吸附洗脫特性參數

比上柱量S：達吸附終點時，單位質量干樹脂吸附夾帶成分的和。S=(上柱液中成分質量-過柱流出液中成分質量)/干樹脂質量。

比吸附量A：單位質量干樹脂吸附成分的總和。A=(上柱液中成分質量-過柱流出液中成分質量-洗脫成分質量)/干樹脂質量。

比洗脫量E：吸附飽和后，用一定量溶劑洗脫至終點，單位質量干樹脂洗脫成分的質量。E= 洗脫成分質量/干樹脂質量。

2.7 影響吸附的因素考察

2.7.1 吸附樹脂的篩選 按照“2.4.3”項下的方法對5種樹脂進行預處理，取適量(相當于1 g干樹脂)處理后的樹脂，裝入玻璃柱中。將質量濃度為9.9 mg/mL的丹參樣品液1 mL，加于各柱頂，先用水以相同的流速洗脫，再用10%、20%、30%乙醇梯度洗脫，分段收集過柱殘液與水洗液，供含量測定用。根據計算結果可知，不同樹脂對丹酚酸B的吸附與解吸附效果有差別，其中在SIPI905與D101樹脂的比上柱量和比洗脫量都較大，說明這兩種型號的樹脂吸附與解吸附的性能較強，較宜選擇使用。見表4。

表4 丹酚酸B的吸附和洗脫量

2.7.2 吸附速率測定 按照“2.4.3”項下的方法對5種樹脂進行預處理，取適量(相當于1 g干樹脂)處理后的5種樹脂，置于具塞錐形瓶中，加樣品液2 mL，至恒溫震蕩器中室溫振蕩，分別于0、2、4、6、8、18 h取樣，測定樣品液中丹酚酸B的含量，計算樹脂對樣品的比吸附量，根據以下公式計算吸附速率。結果表明，SIPI905樹脂的吸附速率最快，綜合考慮2個因素，以選擇SIPl905樹脂為佳。見表5。

Kt=-ln(1-Qt/Q)。注：Kt：吸附速率常數；T：吸附時間；Qt：t時間內的吸附量；Q：平衡吸附量。

表5 不同樹脂類型對丹酚酸B的吸附速率 K(h-1)

2.7.3 樣品濃度對吸附效果影響 按照“2.4.3”項下的方法對SIPI905樹脂進行預處理，稱取6份處理后的樹脂，濕法裝柱。將6份丹酚酸B質量濃度為0.5750、0.8625、1.1500、1.4375、1.7254、2.3000 mg·mL-1的樣品液2 mL，分別加于各柱頂，用水以相同流速通過大孔樹脂，待完全吸附后，測定吸附后樣品液中丹酚酸B含量，計算比吸附量。從結果可以看出，隨著樣品液濃度的增加，比吸附量也相應增加，且比吸附量與樣品的濃度之間符合弗蘭德里希(Freundlich)吸附等溫式和朗繆爾(Langmuir)方程，由此可見二者之間主要以物理吸附為主。見表6。

表6 樣品濃度對大孔樹脂吸附的影響

注：C0上柱樣品丹酚酸B的濃度，X/M比吸附量。對Frendlich公式擬合：lgX/M=1.0265lgC0+0.8562，r=0.9818；對Langmuir公式擬合：1/X/M=0.1289/C0+0.0092，r=0.9723。

2.7.4 鹽溶液對吸附效果的影響 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預處理，稱取5份(相當于1 g干樹脂)預處理后的SIPI905型樹脂置于具塞錐形瓶中，加入2 mL丹參樣品液，再分別往瓶中加入質量分數為0%、4%、8%、12%、16%NaCl溶液1 mL。于25 ℃、120 r/min水浴恒溫恒速振蕩1h，抽濾得上清液，測量濾液中丹酚酸B含量并計算樹脂的比上柱量。從表7數據可以看出，鹽溶液的存在會使比上柱量減小，因此樣品液中應避免鹽類。見表7。

表7 鹽溶液濃度對大孔樹脂吸附的影響

2.7.5 溫度對吸附效果的影響 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預處理，稱取5份等量(相當于1 g干樹脂)預處理后的SIPI905型樹脂置于具塞錐形瓶中，并加入2 mL丹參樣品液，放置在120 r/min的振蕩器中，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下震蕩1 h，抽濾得上清液，測定濾液中丹酚酸B含量。結果表明，溫度對吸附純化的效果影響較大，在室溫范圍內對吸附影響較小，比上柱量隨著溫度的升高而下降。見表8。

表8 溫度對大孔樹脂吸附的影響

2.7.6 最大上樣量的確定 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預處理，稱取處理后的SIPI905型樹脂適量5份(相當于5g干樹脂)，分別裝入5根層析柱，加樣品液5、10、15、20、25 mL，靜置30 min，流出液重吸附3次，再用蒸餾水、20%乙醇各100 mL洗脫，收集20%乙醇洗脫液，測定丹酚酸B含量。結果表明，上樣量達15 mL后，洗脫液中丹酚酸B含量無顯著性增加，即超過樹脂的吸附容量，因此15 mL為飽和上樣量。見表9。

表9 上柱量對丹酚酸B得量的影響

2.7.7 最佳吸附時間的確定 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預處理，稱取處理后的SIPI905型樹脂適量5份(相當于5 g干樹脂)，分別裝入5根層析柱，取15 mL丹參樣品液上樣，流出液重吸附3次，5根層析柱分別靜置10、15、30、60 min，依次用蒸餾水、20%乙醇各150 mL洗脫，收集20%乙醇洗脫液，測定丹酚酸B含量。結果表明，靜置30 min時，洗脫液中丹酚酸B含量最高，時間過短，吸附不完全，時間過長，解吸附難。見表10。

2.8 洗脫工藝參數考察

2.8.1 洗脫溶劑選擇 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預處理，裝柱(柱內徑與長度比為1∶10，干重10 g)，取15 mL丹參樣品液上樣，依次用蒸餾水、10%、20%、30%、50%乙醇各200 mL梯度洗脫，流速為1 mL/min，每50 mL收集1份，共20份；分別蒸干，加蒸餾水溶解，過濾，定容至5 mL，編號，測定丹酚酸B含量。以樣品編號為橫坐標，丹酚酸B含量為縱坐標，繪制洗脫曲線。結果表明，20%～30%的乙醇洗脫液中丹酚酸B含量較高，占總得率的88.2%，且解吸附能力20%乙醇強于30%乙醇，故確定洗脫條件為先用蒸餾水洗去雜質，再用20%乙醇洗脫丹參中丹酚酸B。見圖1。

表10 吸附時間對丹酚酸B得量的影響

圖1 丹參樣品液洗脫曲線

2.8.2 洗脫溶劑用量的選擇及洗脫率的測定 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預處理，裝柱(柱內徑與長度比為1∶10，干重10 g)，取15 mL丹參樣品液上樣，靜置30 min，先用250 mL蒸餾水洗脫，再用20%乙醇250 mL分次(50 mL/次)洗脫，洗脫液流速為1 mL/min，共收集5份，分別蒸干，用甲醇溶解，過濾，定容至5 mL，分別測定丹酚酸B得量。結果表明，丹酚酸B集中在前150mL內被洗脫，故確定20%乙醇洗脫劑用量為150 mL。見表11。

表11 洗脫溶劑用量對丹酚酸B得量的影響

2.8.3 驗證試驗 取同一批藥材，按照優選的工藝條件進行大孔吸附樹脂吸附的驗證試驗，結果洗脫液中的總固體物得率分別為5.56%、5.49%、5.62%，平均值為5.56%；丹酚酸B得率分別為3.78%、3.57%、3.48%，平均值為3.61%，丹酚酸B得量占固體物量的64.98%，表明大孔樹脂的純化工藝基本合理。工藝條件為1 g丹參提取物，丹參中丹酚酸B的最大上樣量(即比吸附量)為9.20 mg/g，洗脫劑為20%乙醇，用量為150 mL。

2.8.4 樹脂再生的考察 按照“2.4.3”項下方法對SIPI905樹脂進行預處理，取適量(相當于1 g干樹脂)處理后的樹脂，裝入玻璃柱中。取1 mL丹參樣品液進行上柱、吸附和洗脫，在同一根樹脂上重復操作5次，分別計算5次丹酚酸B的吸附量。結果表明，樹脂經連續使用3次后吸附率下降，應考慮對樹脂進行再生處理。見表12。

表12 樹脂重復利用次數對丹酚酸B吸附量的影響

3 討論

本實驗采用3種提取方法同時提取丹參中兩種有效成分丹參酮IIA和丹酚酸B，以兩者的提取率，結合抗心肌缺血實驗的血液流變參數為評價指標，考察并確定該兩種成分的最佳提取工藝。采用超聲技術提取丹參有效成分，利用超聲波的特性可加速藥物有效成分進入溶劑。脂溶性成分丹參酮具有活血化瘀的作用[14]，但對熱不穩定，在提取、純化、干燥過程中易降解，若要提高其保留率，需采用超臨界萃取工藝。抗心肌缺血主要藥效試驗結果表明，SFE-CO2萃取樣品較乙醇超聲提取樣品的藥效作用稍強，但經統計學處理組間無顯著性差異，為降低成本，簡化工藝，保證質量穩定，宜采用乙醇超聲提取。

在此基礎上，本實驗從樹脂選擇、上樣流速、樣品濃度、溫度等方面考察并得到水溶性成分丹酚酸B的最佳純化工藝參數，通過驗證表明其純化效果較好。SIPI905大孔樹脂具有吸附“大、快、高”及再生處理方便等優點，其吸附性與篩分性相結合的特點尤適合于丹參中丹酚酸B的分離、純化。樹脂對有效成分的吸附一般分為四個階段：①溶液中外擴散；②樹脂表面液膜擴散；③樹脂內部孔徑擴散；④吸附和解吸附。丹酚酸B在大孔樹脂上的吸附隨著溫度的升高，吸附量下降，說明該吸附過程屬于放熱過程，降低溫度有利于吸附。吸附量與藥液符合弗蘭德里希(Freundlich)吸附模型和朗繆爾(Langmuir)方程，即在達到平衡吸附之前，同一溫度下，濃度越大，吸附量也會增大。

大孔樹脂吸附分離技術已日益顯示其獨特的效果，不僅為中藥制劑質量控制研究提供了更有效、可靠的純化富集手段，更重要的是改善了傳統中藥制劑“粗、大、黑”的外觀和服用量過大等缺點。目前，實驗室階段的研究日益增多，有助于后期工業化的大規模應用，今后若大孔吸附樹脂技術可以與其他技術相結合，將能為中藥的分離純化、產品開發提供更可靠的保證。