瓜子金多糖的提取工藝優(yōu)化及含量測定

許 耀

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450053)

瓜子金為遠志科植物瓜子金PolygalajaponicaHoutt.的干燥全草，收載于2015版藥典，辛、苦、平，歸肺經(jīng)，具有祛痰止咳、活血消腫、解毒止痛等功效，臨床用于治療咳嗽痰多、咽喉腫痛；外治跌打損傷、疔瘡癤腫、蛇蟲咬傷[1]。瓜子金中主要含有皂苷類、黃酮類、有機酸類、揮發(fā)油類等成分[2]，能鎮(zhèn)咳祛痰、益智安神、活血散瘀，民間應(yīng)用十分普遍且療效顯著[3]。

從植物中提取出來的多糖具有十分重要而且廣泛的生理活性，如提高免疫、抗腫瘤、降低血脂、降血糖、抗炎、抗疲勞、抗氧化、抗衰老等[4-7]。目前提取多糖較常用的提取方法有水提取法、堿提取法、酶提取法等[8-10]。其中水溶性多糖常用熱水提取法，所得的多糖溶液通過離心除去不溶物，然后利用多糖不溶于高濃度乙醇性質(zhì)，進行沉淀，此方法不需要特殊的設(shè)備，成本低、操作簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)。本實驗通過考察水提方法，確定最佳提取工藝條件，同時建立瓜子金多糖的含量測定方法，以期為瓜子金多糖的研究和進一步工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

TU-1810型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器公司)； Satorius-CPA225D十萬分之一天平(奧多力斯科學(xué)儀器有限公司)；DZF-300型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鄭州長城科工有限公司)；SHZ-D型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；LD-25離心機(北京京立儀器有限公司)。

1.2 試劑

D-無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201206)；濃硫酸、苯酚、95%乙醇、無水乙醚等試劑均為分析純。

1.3 實驗藥材

瓜子金藥材購買于鄭州市東升大藥房，經(jīng)鑒定為中藥遠志科植物瓜子金PolygalajaponicaHoutt.的干燥全草，經(jīng)粉碎并過40目篩，得瓜子金粗粉。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 葡萄糖標準品溶液的配制 精密稱取105 ℃烘干至恒重的無水葡萄糖標準品100.0 mg，溶解到100mL容量瓶中定容，反復(fù)上下?lián)u勻，即得濃度為1000.0 μg/mL的葡萄糖儲備液，置于4 ℃冰箱中備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取瓜子金藥材粉末1.0 g，精密稱定，加石油醚(60～90 ℃)20 mL，回流提取25 min，過濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后加乙醇50 mL加熱回流40 min，過濾，濾渣加蒸餾水加熱回流2次，每次加蒸餾水50 mL，每次提取時間1.5 h，濾液合并，定容至100 mL，取1mL定容至5.0 mL，即得瓜子金多糖供試品溶液。

2.1.3 最佳測定波長的選擇 精密吸取葡萄糖儲備液1.0 mL，置于25 mL具塞試管中，另取蒸餾水1.0 mL置于另一25 mL具塞試管中，作為空白對照，分別加入1.0 mL 5%苯酚飽和溶液和濃硫酸溶液5 mL顯色，震蕩搖晃均勻，室溫放置40 min后，于200～900 nm進行全波長掃描。由掃描結(jié)果可知，葡萄糖儲備液在490 nm處有最大吸光度，故選490 nm為測定波長。

2.1.4 標準曲線的建立 分別精密吸取葡萄糖儲備液2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 mL于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，反復(fù)上下?lián)u勻，得葡萄糖濃度分別為20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00 μg/mL的標準溶液。分別量取上述葡萄糖標準液和蒸餾水空白溶液1.0 mL于25 mL試管中，按照“2.1.3”項下實驗操作，結(jié)果如表1。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：Y=0.014 5X+0.021 3，r2=0.999 6(n=6)，結(jié)果表明，葡萄糖濃度在20.00～70.00 μg/mL范圍內(nèi)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度實驗 取濃度為30.00 μg/mL的葡萄糖標準溶液1.0 mL，按照“2.1.3”項下操作，連續(xù)測定5次，計算吸光度的RSD值為0.526%，這表明儀器精密度良好。

2.1.6 重現(xiàn)性實驗 配置40.00 μg/mL的葡萄糖標準溶液6份，各取1.0 mL入具塞試管中，按照“2.1.3”項下操作，測定多糖含量，計算吸光度的RSD為1.27%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實驗 取濃度為40.00 μg/mL的葡萄糖溶液1.0 mL，依 “2.1.3”項下操作，每隔15min測定吸光度一次，連續(xù)測定2 h，其相對標準偏差RSD值為0.218%，表明樣品在2 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.8 回收率實驗 準確精密稱取樣品多糖(糖含量為10.90%)6份，每份約2.0 mg，分別加入濃度為43.6 μg/mL葡萄糖溶液5 mL定容至25 mL容量瓶中，混勻，各溶液取1.0 mL，依照“2.1.3”項下操作，測定吸光度，計算回收率，得平均回收率為99.5%，RSD=1.12%，實驗結(jié)果見表1，可見該方法具有良好的回收率。

表1 回收率實驗結(jié)果

由上面的結(jié)果可知，該方案的精密性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和加樣回收率實驗均穩(wěn)定良好，該實驗方法穩(wěn)定、成熟，可用于瓜子金多糖含量測定的進一步研究。

2.2 瓜子金多糖水提單因素考察

2.2.1 提取溫度對多糖提取的影響 取瓜子金藥材粉末(過40目篩)5份，各10 g，分別在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴條件下提取多糖，料液比為1∶20，提取時間3 h,提取2次，提取液合并，離心去殘渣，然后濃縮至固液比1∶2(藥粉重量∶溶液體積)，加95%乙醇至醇沉濃度為80%，置于4 ℃冰箱中靜置過夜，離心得多糖沉淀，用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，真空干燥得瓜子金粗多糖，并計算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量2個指標作為衡量提取效率的條件，得綜合評分計算結(jié)果，以綜合評分與提取溫度做曲線。結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對瓜子金多糖提取率的影響

由圖1可以看出，在90 ℃之前，隨著提取溫度的升高，綜合評分逐漸增加，而超過90 ℃后，提取效率綜合評分增加緩慢，在100 ℃時評分最好，因此，本實驗選擇100 ℃作為最佳提取溫度。正交實驗設(shè)計選擇提取時間為80 ℃、90 ℃、100 ℃ 3個水平。

2.2.2 料液比對多糖提取的影響 取瓜子金粉末5份，每份各10 g，分別以1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40五種不同的料液比提取多糖，提取溫度為100 ℃，提取時間3 h，提取2次，合并提取液，以下實驗步驟如“2.1.1”操作。計算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量兩個指標衡量提取效率，并計算綜合評分，以綜合評分與料液比作曲線圖。結(jié)果見圖2。

圖2 瓜子金多糖料液比提取結(jié)果

由圖2可以看出，隨著料液比的加大，當料液比為1∶20時綜合評分開始顯著增加，當達到1∶30時為最好，考慮到經(jīng)濟效益，隨著提取溶劑的加大，成本也會大幅增加，由于在料液比1∶20和1∶30之間顯著增加，所以正交實驗料液比選取1∶20、1∶25、1∶30三個水平進行考察。

2.2.3 提取時間對多糖提取的影響 取瓜子金粉末5份，每份10 g，分別在0.5、1、2、3、4 h五個不同提取時間下提取多糖，料液比1∶30，提取溫度為100 ℃，提取3次，每次2h，合并濾液，以下實驗步驟如“2.1.1”操作。計算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量兩個指標衡量提取效率，綜合評分如下，以綜合評分與提取時間作曲線。結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，隨著提取時間的增加，瓜子金多糖提取效率逐漸增加，當?shù)? h為最佳，當時間在長綜合評分稍微有些下降，所以本實驗正交實驗時間選取2 h、3 h、4 h三個水平。

圖3 提取時間對瓜子金多糖提取率的影響

2.2.4 提取次數(shù)對多糖提取的影響 取瓜子金粉末5份，每份10 g，提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5次，料液比為1∶30，提取溫度為100 ℃，提取時間2 h，合并濾液，以下實驗步驟依“2.1.1”操作。計算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量作為衡量提取效率的兩個指標，并計算得綜合評分，以綜合評分與提取次數(shù)作曲線。結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，綜合評分逐漸增大，從第2次開始，綜合評分增加趨勢變緩，考慮到經(jīng)濟因素，本實驗正交實驗設(shè)計選擇提取2、3、4次3個水平。

圖4 瓜子金多糖提取率受提取次數(shù)的影響

2.2.5 醇沉濃度對多糖提取的影響 取瓜子金粉末5份，每份10g藥材，料液比為1∶30，提取溫度為100℃，提取時間2h，提取3次，合并濾液，離心去殘渣，提取液濃縮至固液比1∶1.5，加95%乙醇至不同的乙醇醇沉濃度，分別為70%、75%、80%、85%、90%，置4℃冰箱中靜置過夜，以下實驗操作如“2.1.1”。計算多糖得率和含量，以多糖得率及糖含量為衡量提取效率的兩個指標，綜合評分計算如下，以綜合評分與醇沉濃度作曲線。結(jié)果見圖5。

圖5 醇沉濃度對瓜子金多糖提取效果的影響

由圖5可以看出，隨著醇沉濃度的增加，綜合評分不斷增加，當醇沉濃度達80%時，綜合評分最大，因此，本實驗選擇80%乙醇最為最終醇沉濃度。

2.3 瓜子金多糖水提正交實驗優(yōu)選最佳水提工藝

2.3.1 因素水平表的設(shè)計 基于以上各單因素實驗結(jié)果，選擇提取溫度(A)、料液比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)四個因素作為參考因素，每個因素均選取3個水平，實驗按L9(34)正交表安排。

2.3.2 數(shù)據(jù)的處理方法 實驗結(jié)果以瓜子金多糖得率和糖含量作為衡量提取效率的雙重指標，根據(jù)多糖得率(a)和糖含量(b)的作用，用該加權(quán)評分法(權(quán)重各占50%)綜合評估瓜子金多糖提取條件。評分標準：以各項值除以該列的最大值，再乘100，即為該項的得分，這樣可把多糖得率和糖含量轉(zhuǎn)化為0～100之間的數(shù)值，對這兩項指標進行求和，運用公式M=0.5a+0.5b，即得綜合評分(M)。

2.3.3 瓜子金樣品制備及指標測定 分別稱取瓜子金粉10 g，按照正交設(shè)計表的各個因素水平進行提取，每個實驗平行1份，提取液濃縮至料液比1∶1.5，80%醇沉，4 ℃冰箱中靜置過夜，以下實驗步驟如“2.1.1”操作，計算多糖得率及含量。正交試驗設(shè)計的因素水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3，正交試驗分析見表4，方差分析見表5。

表2 水提工藝因素水平

表3 實驗結(jié)果

表4 正交實驗及結(jié)果

表5 方差分析

注：**P<0.01；*P<0.05；F0.01(2,9)=8.02；F0.05(2,9)=4.26。

正交實驗結(jié)果表明溫度和提取次數(shù)對實驗結(jié)果影響極顯著(P<0.01),料液比和提取時間對實驗結(jié)果影響顯著(0.01A>C>B。根據(jù)實驗結(jié)果選取最佳的提取工藝為A2B2C1D2，即取瓜子金藥粉(過40目篩)，加入25倍量水，90℃回流提取3次，每次2h。

2.4 驗證試驗

以上實驗得出瓜子金藥材的最佳提取工藝條件為：取瓜子金藥材打粉過40目篩，加水25倍量，90℃回流提取3次，每次2h，過濾離心，合并提取的濾液，濃縮至固液比1∶1.5(藥粉重∶溶液體積)，加乙醇至最終醇沉濃度為80%，置于4℃冰箱中靜置過夜，離心，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，揮干，即得瓜子金多糖。為考察上述工藝的穩(wěn)定性，按該最佳工藝方法提取3份，分別測定計算多糖得率及糖含量，計算平均多糖得率為12.4%，平均糖含量為11.3%。

3 討論

目前對中藥瓜子金的研究主要集中在皂苷類等成分的研究[11]，對瓜子金多糖的提取工藝及含量測定均未見報道。本文首次建立瓜子金多糖的含量測定方法并對其提取工藝進行研究。對多糖提取工藝的研究，目前主要以多糖的提取率為指標對其提取工藝進行考察[12-13]，而未考慮多糖產(chǎn)物的純度，因此，此單指標確定的提取方法存在一定的局限性，為進一步完善提高多糖提取工藝，本研究采用了雙指標方法對中藥瓜子金多糖的提取工藝進行優(yōu)化。

本試驗建立了瓜子金多糖的含量測定方法，同時對影響瓜子金多糖提取率和多糖含量的提取溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)、醇沉濃度等5個因素分別進行了單因素分析，后利用正交設(shè)計考察提取溫度、料液比、提取時間和提取次數(shù)對瓜子金多糖提取率和多糖含量的影響，以瓜子金多糖得率和多糖含量作為衡量提取效率的雙重指標，采用加權(quán)評分方法綜合評估瓜子金多糖的提取條件，方法科學(xué)可行、操作簡單，所得產(chǎn)物瓜子金多糖的提取率及純度均較高，為瓜子金藥材及其多糖的進一步開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。