四物湯補血作用有效部位配伍優化及作用機制研究

劉穎新，劉利利，毛群芳，彭麗英，陳 容

(湖南中醫藥高等專科學校 藥學系，湖南 株洲 412012)

四物湯來源于《仙授理傷續斷秘方》一書，是臨床上補血、活血兼顧的代表方劑。四物湯由熟地、當歸、白芍、川芎四味藥配伍組成，主要用于治療營血虛滯所致的血虛失養、月經不調[1-2]等癥。前期研究表明，四物湯補血作用有效部位為多糖、二氯甲烷和正丁醇部位。基于中藥復方協同作用，本研究采用均勻設計法對四物湯中3種起補血作用的主要部位進行配伍研究，以篩選出四物湯補血有效部位的最優配比，并對配比后的有效部位補血機制進行了探討。

1 動物、試藥與儀器

SPF級雌性昆明小鼠，體質量18～22 g(長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011)。

熟地、白芍、當歸、川芎均購于長沙佰佳藥材公司，經湖南中醫藥高等專科學校生藥教研室羅紅梅副教授鑒定，分別為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的炮制加工品、毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根、傘形科植物當歸(Angelicasinensi(Oliv.)Diels.)的干燥根和傘形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖。自行提取，分離得到多糖部位、二氯甲烷部位和正丁醇部位備用。環磷酰胺(批號：17052531，0.2g/支，江蘇盛迪醫藥有限公司)，驢膠補血顆粒(批號：201706058，20 g/袋，九芝堂股份有限公司)。Na+-K+-ATP酶活性檢測試劑盒(批號：160506，南京建成生物工程研究所)；白細胞介素-3(IL-3)及促紅細胞生成素(EPO)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。

BC-5000型血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；Model 680型酶標儀(美國BIO-RAD公司)；JA2603B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物模型的制備

參照文獻[3-4]，采用ip環磷酰胺的方法制備小鼠血虛模型。小鼠ip給予環磷酰胺生理鹽水溶液40 mg/kg，連續3 d。

2.2 分組與給藥

將提取的四物湯多糖、二氯甲烷和正丁醇3個補血有效部位作為考察因素，根據前期研究的有效劑量和相關文獻[5]，分別確定3個部位的劑量范圍為多糖1 000～1 600 mg/kg、二氯甲烷15～75 mg/kg、正丁醇14～62 mg/kg。按照U7(76)均勻設計表安排試驗，得到均勻設計試驗方案，見表1。將實驗動物100只，隨機分成10組，每組10只，采用ip環磷酰胺復制小鼠骨髓造血功能抑制模型，以外周血象、脾臟指數和胸腺指數為考察指標。根據表2方案，按劑量配比配制灌胃液，ig給藥，同時設對照組和驢膠補血顆粒陽性藥物組，陽性藥物組按12.13 g/kg劑量ig給予驢膠補血顆粒(按照臨床給藥劑量2倍折算成動物給藥劑量)。實驗動物適應性飼養3 d，對照組每天ig 0.5 %CMC-Na，連續8 d。模型組每天ig 0.5%CMC-Na，連續8d，并在第4天起ip CTX(40 mg/kg)，連續給藥3 d。各給藥組每天ig不同配比的有效部位灌胃液，共8 d，并于開始給藥的第4天起ip CTX(40 mg/kg)，連續3 d。陽性藥物組每天ig驢膠補血顆粒共8 d，于第4天起ip CTX(40 mg/kg)，連續3d。于第9天將各組試驗動物摘眼球取血適量，一部分用于血常規檢測，另一部分用于紅細胞膜中Na+-K+-ATP酶活性和IL-3、EPO含量測定。

表1 因素水平表 (mg/kg)

表2 給藥方案 (mg/kg)

2.3 指標檢測

各組動物于第9天采用摘眼球取血適量，置于抗凝EP管(EDTA)中，通過血細胞分析儀檢測血常規，指標包括紅細胞計數(RBC)、紅細胞比容(HCT)、血紅蛋白(HGB)等3項指標。測定Na+-K+-ATP酶的活性，嚴格按試劑盒說明書要求進行測定，酶活性以每毫克蛋白每小時所產生的無機磷的量來表示(單位：μmol·mg-1·h-1)。另取適量全血置于無抗凝劑的EP管中，按照ELISA試劑盒說明書要求測定血清中IL-3和EPO含量。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 四物湯有效部位不同配比對血虛模型小鼠外周血象的影響

結果見表3，與對照組比較，模型組小鼠HCT、RBC、HGB明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，給藥A、B、G組明顯升高HCT、RBC(P<0.05、P<0.01)；C、E組明顯升高HCT、RBC、HGB(P<0.05)；D組明顯升高HCT和HGB(P<0.05)；F組RBC升高和HGB作用顯著(P<0.01)。

表3 四物湯有效部位不同配比對血虛模型小鼠外周血象的影響

注：與對照組比較：#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01，下同；#P<0.05,##P<0.01 vs contrl group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group,same as below。

表4 指標評分

3.2 四物湯補血有效部位最優配比

分別以HCT、RBC、HGB綜合得分為指標，經二次多項式逐步回歸法對數據進行處理，經二次多項式逐步回歸，得到回歸方程：

Y=86.8+7.62×10-3X1+3.29×10-2X2+0.265X3-2.57×10-4X1X3-2.88×10-4X32(X1為多糖部位，X2為二氯甲烷部位，X3為正丁醇部位)。方程經過調整后r=0.9999，S=0.0685，F=1091，F0.05(5,1)=230.2,F>F0.05(5,1)，回歸方程顯著。此方程中各因素的最優配比為：X1=1 600mg/kg；X2=75mg/kg；X3=14 mg/kg。

3.3 四物湯補血有效部位配比優化方的驗證

KM小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。分別為對照組、模型組、陽性對照組(驢膠補血顆粒12.13 g/kg)、四物湯補血有效部位配比優化方組(即多糖1 600mg/kg+二氯甲烷部位75mg/kg+正丁醇部位14mg/kg)和四物湯組(生藥6.37 g/kg)。按2.2項方法給藥，以HCT、RBC和HGB作為藥效學評價指標，結果見表5。配比優化方組RBC和HGB與模型組相比，差異非常顯著(P<0.01)，HCT與模型組比較，差異顯著(P<0.05)。與四物湯組相比，配比優化組對HCT、RBC和HGB的升高作用與四物湯組相當，表明經優化后的組方有較好的補血效果。

表5 配比優化方驗證試驗結果

3.4 四物湯有效部位配比優化方對IL-3、EPO及紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影響

與對照組比較，模型組IL-3、EPO含量和Na+-K+-ATP酶水平降低非常顯著(P<0.01)。與模型組比較，配比優化方能顯著升高IL-3和Na+-K+-ATP 酶水平(P<0.05)；升高EPO水平作用非常顯著(P<0.01)。結果見表6。

表6 配比優化方對紅細胞膜Na+-K+-ATP酶活性、IL-3及EPO的影響

4 討論

我國中藥配伍理論是傳統醫學之精華。利用現代醫學理論、技術與數學理論相結合深入探究中藥配伍內涵，進一步闡明藥效物質基礎，是中醫藥現代化的要求和任務[7]。均勻設計將數論和多元統計相結合，尤其適用于多因素和多水平的試驗研究。在條件變化范圍大且需要較多水平試驗的情況下，與正交設計相比，可明顯減少試驗次數，并通過回歸方程得出最佳實驗條件[8-10]。本試驗采用均勻設計對四物湯中3種補血有效部位進行最佳配比研究，實驗結果表明，四物湯3個有效部位的7種組合均有不同程度的補血作用。經均勻設計得到的回歸方程所預測的最佳配比療效確切，并與四物湯原方療效相當，表明運用均勻設計法結合藥效學試驗優化中藥有效部位配比的方法是可行的。

白細胞介素-3(IL-3)，又名多向集落刺激因子(multi-CSF)，它由T淋巴細胞產生，是細胞因子家族中的一員。IL-3屬于正向調節性因子，能夠調節造血干細胞的增殖與分化，對造血細胞尤其是對巨核細胞有重要的調節功能[11-13]。本研究中，模型組小鼠與對照組比較血液中的IL-3含量顯著降低，四物湯補血有效部位配比優化方對小鼠血液中的IL-3含量影響顯著，推測配比優化方補血作用是通過調節IL-3的生成而起作用。促紅細胞生成素(EPO) 是一種特異性作用于紅系祖細胞的激素糖蛋白，它在機體中對紅細胞的生成有增強作用，當紅細胞數量減少或攜氧能力下降時，可刺激腎臟生成和釋放EPO,促進骨髓內紅細胞的生成[14-15]。本研究結果表明，與空白對照組比較，模型組小鼠血清中EPO水平明顯降低，這可能是由于紅系祖細胞被大量破壞，從而造成血清中EPO水平明顯降低。四物湯配比優化方可促使血清中EPO水平明顯升高，表明配比優化方可以促進腎臟大量合成EPO進入血清。Na+-K+-ATP酶作為一種存在于細胞膜上的跨膜蛋白，它可以調節細胞內的Na+、K+離子濃度，維持正常膜電位和細胞滲透壓。Na+-K+-ATP酶對于維持正常紅細胞形態、結構、功能具有重要作用[16,17]。血虛證最主要的病理表現是紅細胞數量減少，研究表明，紅細胞數量的減少可引起機體的新陳代謝減慢，從而導致紅細胞膜上Na+-K+-ATP酶活性隨機體新陳代謝的減弱而降低。本研究中，四物湯配伍優化方組與模型組比較能夠顯著提高Na+-K+-ATP酶活性，使紅細胞恢復到正常的形態和功能。

綜上所述，經過均勻設計優化后得到的四物湯有效部位配比方在補血效果上與四物湯原方相當，成分更清楚，質量更易控制，符合中醫藥現代化的要求。其補血作用可能與增強Na+-K+-ATP酶活性，提高IL-3和EPO水平有一定相關性。