探討惡性淋巴瘤診斷中Ig/TCR基因重排的分子病理檢測

蔡四忠

（遼寧省撫順市第四醫(yī)院，遼寧 撫順 113123）

按照病理類型分類，惡性淋巴瘤可分為B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、NK細胞淋巴瘤，臨床研究指出，惡性淋巴瘤起源于淋巴造血系統(tǒng)，關于其病因目前尚不明確，臨床提倡早發(fā)現(xiàn)早治療[1]。隨著對惡性淋巴細胞的不斷研究，逐步形成了多元化的診斷和治療策略，尤其是在診斷方面可通過免疫組化方法、病理形態(tài)學方法、分子遺傳學以及臨床癥狀癥狀表現(xiàn)等進行綜合分析。遺傳學技術的開展與應用使得惡性淋巴瘤分子病理檢測輔助診斷成為一種可能。為明確惡性淋巴瘤診斷中Ig/TCR基因重排分子病理特點以及在臨床病理診斷中的應用價值，筆者結合我院在2016年1月至2018年6月研究的180例惡性淋巴瘤患者以及30例淋巴反應性增生患者，探討Ig/TCR基因重排的分子病理檢測對其診斷價值，相關內(nèi)容分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：研究時間在2016年1月至2018年6月，研究對象為180例惡性淋巴瘤患者以及30例淋巴反應性增生患者，共有210例，其中男性患者139例，女性患者71例，年齡24～64歲、平均年齡（42.25±4.67）歲，所有患者同意進行研究，各項資料完整。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：研究中的試劑主要有：①購買自TakaRa公司的10×PCRbutter、rTaqDNA聚合酶；②天根生化科技有限公司生產(chǎn)的50bp marker、6×loading butter、2.5 mmol/Ld、NRP mixture；③QIAGEN公司提供的QIAamp?DNA FFPEtissie Kit；④上海生工生物工程有限公司合成的對照參考基因、引物等。

1.2.2 方法：整個操作過程包括以下步驟：①提取DNA。將獲取的組織切成厚度為4 μm石蠟切片，共需要5～10片，脫蠟處理，根據(jù)QIAGEN公司提供的QIAamp?DNA FFPEtissie Kit操作說明完成實際檢測，對濃度以及純度的檢測采用紫外分光光度計；②引物設計：對Ig基因克隆性重排的47條引物使用3730毛細血管電泳檢測，通過引物組合進行檢測，檢測項目包括輕鏈，包括IgLκ、IGLλ，重鏈為IgH，重鏈分為A、B、C、D、E五組，檢測VH-JH。IgLκ和對Vκ-Jλ、Vκ-κde檢測，涉及到IgLκ-A、IgLκ-B，Vλ-Jλ使用IgLλ檢測。TCR基因克隆充分分析引物56條，通過引物組合完成TCPβ、TCRγ以及TCRδ檢測，將TCPβ分為三組，分別是A組、B組、C組，對Vβ-Jβ以及Dβ-Jβ的檢測。將TCRγ檢測分為A組與B組，內(nèi)對照引物S共有4條，擴增產(chǎn)物對應的片段長度包括101bp、200bp、300bp以及395bp；③PCR擴增：PCR擴增體系為25 μL，引物為0.1 μmol/L，2UrTap DNA聚合酶，設置如下反應條件：預變性溫度94 ℃，時間10 min。94 ℃，45 s，60 ℃，45 s，72 ℃，90 s，反復進行循環(huán)，循環(huán)共有40次，在72 ℃條件下延伸10 min，并在4 ℃條件下保存；④毛細管電泳、基因掃描：使用ABI 3730XL遺傳分析儀對PCR擴增產(chǎn)物四十毛細管電泳處理，使用配套軟件對基因數(shù)據(jù)實施處理，對樣本進行DNA質(zhì)量分析期間需要對應的擴增條帶為101bp、200bp、300bp以及395bp，對不同DNA的完整性以及質(zhì)量進行評價。標本如果不能檢測出對應的目的條帶，說明DNA樣本不滿足質(zhì)量要求。

1.3 觀察指標：觀察指標主要是B細胞淋巴瘤Ig基因重排結果以及T細胞性淋巴瘤TCR基因重排分析結果。

1.4 評價標準：不同樣品在擴增處理后，如果對應的擴增產(chǎn)物處于檢測有限范圍內(nèi)，同時能夠獲取擴增產(chǎn)物不連續(xù)信號單峰評價為陽性。沒有熒光信號的或者曲線表現(xiàn)為高斯分布則評定為陰性[2]。

1.5 統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)分析使用Excel，不同數(shù)據(jù)表示為百分率。

2 結 果

2.1 B細胞淋巴瘤Ig基因重排：表1所示為B細胞淋巴瘤Ig基因重排結果，15例淋巴反應性增生沒有Ig基因單克隆重排條帶的擴增。

2.2 T細胞淋巴瘤TCP基因重排結果：表2所示為TCR基因重排與T細胞淋巴瘤組織類型關系分析結果，15例淋巴反應性增生沒有TCR基因單克隆重排條帶的擴增。

3 討 論

惡性腫瘤的研究是戰(zhàn)勝疾病，改善患者生活質(zhì)量以及生存質(zhì)量的重要途徑。淋巴惡性腫瘤作為常見的惡性腫瘤。國內(nèi)統(tǒng)計數(shù)據(jù)資料顯示，惡性淋巴瘤在我國惡性腫瘤中位居11～13位。與此同時，惡性淋巴腫瘤的新發(fā)病例呈現(xiàn)出逐年上升趨勢，整個惡性腫瘤中有4.00%～5.00%為惡性淋巴腫瘤[3]。通過對惡性淋巴細胞瘤的研究對改善惡性淋巴瘤的治療以及預后具有重要意義。

臨床統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，惡性淋巴瘤中絕大多數(shù)為非霍奇金淋巴瘤（NHL），包含了B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、NK細胞淋巴瘤，其中B細胞淋巴瘤占到90.00%～95.00%。T細胞淋巴瘤占到5.00%～7.00%，NK細胞淋巴瘤不足2.00%。有序的V-D-J基因通過重排組合以及拼接后可形成不淋巴細胞編碼，其基因為Ig肽鏈。T淋巴細胞基因編碼則分布于α肽鏈、g肽鏈、β肽鏈以及δ肽鏈?；蛑嘏排c組合過程期間依靠V-D-J、V-J-C基因?qū)崿F(xiàn)重排。不同腫瘤細胞都是來源于同一個克隆的單克隆性重排，較為典型的如Ig基因、TCR基因等。最新研究指出，正常的淋巴組織以及反應性淋巴組織在組織細胞起源方面不具有一致性，本身為多克隆性重排，TCR基因或者是Ig基因。本文研究是建立在國內(nèi)相關文獻報道基礎上，也就是免疫球蛋白（Ig）和T細胞受體（TCR）基因存在重排現(xiàn)象且較為特殊，在淋巴細胞惡性轉(zhuǎn)化之前存在基因重排問題，良性病變中對應的T細胞或者B細胞基因重排形式較為特殊，通過電泳可發(fā)現(xiàn)不同長度DNA存在抹帶，上述研究為本文研究提供了重要的理論基礎。

表1 Ig基因重排與B細胞淋巴瘤組織類型關系分析

表2 TCR基因重排與T細胞淋巴瘤組織類型關系分析

關于相關淋巴細胞瘤基因研究的文獻逐漸增加，有學者[4]對113例B細胞性淋巴瘤患者進行基因檢測，研究中發(fā)現(xiàn)IgH克隆性重排對應陽性率高達82.30%；有學者[5]對彌漫性大B細胞淋巴瘤進行檢查，共有患者46例。通過對IgH克隆性重排的檢測，其中Igl對應的陽性檢出率為36.96%，Igκ對應的陽性檢出率為82.61%，整個IgH克隆性重排陽性率達到91.30%?；谏鲜鱿嚓P研究分析，本研究中對130例惡性淋巴瘤患者以及30例淋巴反應性增生患者進行基因重排檢測，IgHA、IgHB、IgHC、IgHD、IgHE、IgLA、IgLB、IgLA、IgH（A+B+C+D+E）+IgL（A+B）+IgLA陽性率分別為47.69%、33.07%、35.38%、19.23%、6.92%、45.38%、22.30%、30.00%、96.15%。與上述研究相比，研究中樣本數(shù)量明顯增加，最終IgH克隆性重排對應陽性率較上述研究提高，這可能與較為成熟的操作技術有關。關于T細胞性淋巴瘤TCR基因重排的相關研究也較多。有文獻中報道了T細胞性淋巴瘤的研究，共有患者45例，研究后顯示總體陽性率達到91.11%。有文獻中分析了T細胞性淋巴瘤中TCRG、TCRB、TCRD等不同基因陽性率，樣本共有50例，對應的陽性率達到94.00%、84.00%以及36.00%，總體聯(lián)合檢查陽性率達到96.00%[6]。結合上述研究，本文對50例T細胞性淋巴瘤患者基因重排結果進行檢測和分析，涉及到TCR基因重排有TCRB-A、TCRB-B、TCRB-C、TCRG-A、TCRG-B、TCRTCRD、TCRβ+TCR+TCRδ，對應的陽性率分別為32.00%、56.00%、22.00%、60.00%、22.00%、34.00%、78.00%?？傮w陽性率達到78.00%，較上述文獻陽性率降低，可能與患者個體差異性有關。

結合國內(nèi)報道，由然等學者在研究認為外周血淋巴細胞免疫表型分析可為皮膚T細胞淋巴瘤的臨床診斷提供佐證，對其診斷和鑒別具有重要價值。綜合本文研究結果，后期應加大惡性淋巴瘤診多項指標的聯(lián)合診斷研究，便于提高良性與惡性腫瘤病變準確率[7]。

綜上所述，惡性淋巴瘤診斷中Ig/TCR基因重排的分子病理特點可作為B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤診斷的重要參考。